202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására

51

HU 202288 B

52

történik. 10 *j1 16a) példában kapott reakcióelegyet alkalmazunk. 173 ampicillin-rezisztens kolóniát kapunk.

c) Az Fi-Fz-DNS-t tartalmazó kolóniák ellenőrzése

Megvizsgáljuk 11 transzformált kolónia (16b. példa) Fi-Fz-DNS tartalmát a lOe) példában leirt módon. Radioaktiv mintaként az 5. és 6. példákban leirt oligodezoxinukleotidok keverékét alkalmazzuk. Az autoradiogrammon 14 pozitív kolóniát kapunk. Ezek közül öt a pML320, pML321, pML322, pML323 és pML324 jelölést kapja.

17. példa

A pML315 és pML320 kiónok jellemzése

A pML315 és pML320 plazmidokban az Fi-Fz-szekvenciák jellemzése az Fi-Fz-DNS Maxam és Gilbert (11) szerint végzett szekvenálásával történik a 12. példában leírt módon. Mindkét plazmid DNS-inszertjének nukleotidszekvenciája a szintetikus hirudin-gén szekvenciájával azonos.

18. példa

Hirudin-aktivitású polipeptidek szintézise olyan E.coli sejtekkel, amelyek rekombináns hirudin-géneket hordozó plazmidokat tartalmaznak

a) Hirudin-aktivitású polipeptidek szintézise

Mind a 15 rekombináns deszulfatohirudin-gént tartalmazó kiónt, éspedig

E.coli HB101 pML310, E.coli HB101 pML3lí,

E.coli HB101 pML312, E.coli HB101 pML313,

E.coli HB101 pML314, E.coli HB101 pML315,

E.coli HB101 pML316. E.coli HR101 PML317,

E.coli HB101 pML318, E.coü HB101 pML319,

E.coli HB101 pML320, E.coli HB101 pML321,

E.coli HB101 pML322, E.coli HB101 pML323,

E.coli HB101 pML324.

megvizsgáljuk hirudin-aktivitás képződésére.

Ebből a célból a fenti kiónokat 5 ml L-táptalajban egy éjszakán át (16 óra) 37 °C-on és 250 f/p-en tenyésztjük. Az L-táptalaj összetétele a következő:

Bacto Tryptone 10 g

Bacto élesztő-kivonat 5 g

NaCl 5 g

glükóz 5 g

ampicillin 5 g

Az éjszakai kultúrából 1 ml-t a következő napon 25 ml M9-táptalajba viszünk át.

Az M9-táptalaj összetétele a

következő:

NazHP0«-7H20

13,25 g

KH2PO«

3,0 g

NaCl

0,5 g

NH<C1

1,0 g

CaCh-2H20

0,015 g

MgS04-7H20

0,25 g

kazein-hidrolizátum

2,5 g

Bi vitamin

0,0099 g

glükóz

5,0 g

ampicillin

0,1 g

A tenyésztést 37 °C-on és 250 f/p-en addig folytatjuk, amig a baktériumszuszpenzió kb. 0,9-1,0 optikai sűrűséget (ODsm) el nem ér. Utána a sejteket összegyűjtjük (a szaporító kultúra 5 ml-e) és a baktériumokat 0,5 ml 50 mM Tris.HCl (pH = 8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 1 mg/ml lizozimkoncentrációra (Boehringer) állítjuk és 30 percre jég közé tesszük. A szuszpenzió folyékony nitrogénben történő váltakozó lefagyasztásával és váltakozó felengedésével a baktériumokat szétroncsoljuk. Ezt a műveletet ötször ismételjük, utána az elegyet 30 percen át 16 000 f/p-en 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszót megvizsgáljuk deszulfatohirudin-tartalomra oly módon, hogy antitestekkel elegyítjük (vö. 18. példa) a felülúszót HPLC-vel vizsgáljuk vagy mérjük a trombin (15) gátlását. A következő eredményeket kapjuk:

Deszulfato-Baktériumkivonat hirudin

képződése

E.coli HB101 pML310 +

E.coli HB101 pML311 +

E.coli HB101 pML312 +

E.coÜ HB101 pML313 +

E.coli HB101 pML314 +

E.coli HB101 pML315 +

E.coli HB101 pML316 +

E.coü HB101 pML317 +

E.coli HB101 pML318 +

E.coü HB101 pML319 +

E.coli HB101 pML320 +

E.coü HB101 pML321 +

E.coü HB101 pML322 +

E.coü HB101 pML323 +

E.coli HB101 pML324 t

E.coü HB101 pHRil48 (kontroll)

E.coli HB101 pBR322 (kontroll)

E.coü HB101 (kontroll)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

28