202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
43 HU 202288 B 44 DNS-eket alkalikus foszfatázzal megemésztjük és DE 52-kromatogréfiával tisztítjuk (vö. 11a. példa). Ezután a DNS-eket az 5’-végen (■$-^P/ATP-vel) fajlagos aktivitás >5000 Ci/mmól, Amersham, és T4 polinukleotid-kinázzal (P-L-Biochemicals) radioaktivan jelöljük. A radioaktiven jelölt DNS-eket ezután egy második restrikciós endonukleázzal (EcoRII) hasítjuk. A képződött DNS-fragmenteket agarózból gélelúcióval izoláljuk. A pML300 esetében az EcoRII-EcoRI* fragmentből (kb. 109 bázispár) az Fi-DNS nukleotidszekvenciáját, a pML300 esetében az Fz-DNS szekvenciáját az EcoRII-BamHI’-fragmentben Ikb. 122 bázispár) határozzuk meg. (*a radioaktivan jelzett DNS-véget adja meg). Az Fi-DNS-re és F2-DNS-re meghatározott nukleotidszekvenciák azonosak a 8. példában leírtakkal. 13. példa A pML310 expressziós plazmid előállítása a) trp-promoter-operétort tartalmazó linearizált pHRH48/EcoRI/BamHI vektor megszerkesztése (3. ábra és 4. ábra) A. A pl59 plazmid megszerkesztése 10 Mg pBRHtrp (22) plazmidot 50 egység EcoRI-gyel (Biolabas) 60 percen át 37 °C-on hasítunk, és a megemésztett fenolos extrakció után szacharóz-sűrűséggradiensen-(5-23%) 50 mM Tris.HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA-TST 41 rotorban (Kontron AG) frakcionáljuk. A centrifugélás 40 000 f/p-en és 15 °C-on 14 órán át tart. ISCO-gradiensgyűjtővel 1 ml/p áramlási sebességgel 0,3 ml-es frakciókat szedünk. A kisebb fragmentet tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatot TNE-re állítjuk és 2 térfogat etanollal -20 °C-on kicsapjuk. A DNS-t centrifugálás után Eppendorf-csőben 100 pl 10 mM Tris.HCl pH = 7,5, 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Ebből a DNS-fragmentből 5 Mg-°t 5 £®ység BglII-vel (Biolabs) hasítunk 60 percen át 37 °C-on. A reakcióelegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 °C-on 10 percen át inkubáljuk, a DNS-t centrifugálással gyűjtjük és újra 50 m1 50 mM Tris.HCl (pH = 8,0)-ban oldjuk. Ebből az oldatból kiveszünk 2 pl-t (0,2 Mg DNS) és 50 mM TrÍ6.CHl-ben (pH = 8,0) 10 ng/Ml DNS-koncentráció mellett 1 egység borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 30 percen át 37 °C-on. Az oldat 60 percen ét 65 °C-ra való melegítésével az enzimet inaktiváljuk. Kiveszünk 0,04 Mg DNS-t és az 5’-véget 10 mCí U-^PhATP-vel (>5000 Ci/mmól), Amersham és 5 egység T« • polinukleotid-kinázzal (P-L-Biochemicals) 20 m1 reakciótérfogatban 50 mM Tris.HCl (pH = 9,5), 10 mM MgCh, 5 mM DTT összetételű oldatban 30 percen át 37 °C-on való inkubálással jelöljük. A radioaktiv mintát a nem jelölt mintával (lásd fent) keverjük és a DNS-fragmenteket 5-23% szacharóz-sűrűséggradiensen -50 mM Tris.HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA TST 60 rotorban frakcionáljuk. A centrifugálást 60 000 f/p-en 15 °C-on 5 órán át végezzük. 0,2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakció aktivitását a Cserenkov-sugárzás mérésével határozzuk meg és ezzel azonositjuk a fragmenteket. A kis DNS-fragmenst tartalmazó kívánt frakciókat egyesítjük, a DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk és centrifugálás után ismét 20 m1 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. A 32P-jelzett EcoRI-BglII DNS-fragmenst 0,2 egység Taql-gyel (Biolabs) 50 m1 térfogatban 10 percen át 37 °C-on részlegesen hasítjuk. A reakcióelegyet 0,2% SDS-re, 10% glicerinre, 10 mM EDTA-ra, 0,05 brómfenolkékre állítjuk és a DNS-fragmenseket 6%-os poliakrilamid-gélen Tris-borát-EDTA pufferrel (23) szétválasztjuk. Az autoradiogrammon azonositjuk a kívánt EcoRI-Taql fragmentet (a legnagyobb részfragment) tartalmazó sávot. Ezt a fragmenst (L. lásd. 9. ábra) a gélből extrahéljuk és tisztítjuk (19) és 10 m1 10 mM Tris.HCl pH = 7,5, 0,5 mM EDTA oldatban oldjuk. Akceptor-plazmidként Clal-gyel és Eco- RI-gyel hasított pBR322-t alkalmazunk: 2 Mg pBR322-t 4 egység Clal-gyel (Biolabs) 20 m1 reakciótérfogatban 60 percen át 37 °C-on emésztünk. A fehérjét fenollal extrahéljuk, majd a DNS-t 2 térfogat etanollal -80 °C-on 10 perc alatt kicsapjuk. A DNS-t centrifugálóssal gyűjtjük, majd 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen keresztül 37 °C-on 20 m1 reakciótérfogatban megemésztjük. Utána az oldatot 2 térfogat 0,1 M Tris.HCl-val (pH == 8,7) elegyítjük 06 1 egység borjú alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A foszfatázt ezután 65 °C-on 60 percen inkuhálással inaktiváljuk. 100 ng akceptor-plazmidot 5 pl L-DNS-fragmenttel 15 m1 renkc’őtérfogatban 10 mM MgCk, 20 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP összetételű oldatban reakciótérfogat Ml-ként 30 egység T4 DNS-ligézzal (Biolabs) 2 órán át inkubálunk. Ebből az oldatból 5 ul-t adunk egy olyan 200 m1 végtérfogatú elegyhez, amely 150 m1 kalcium-kloriddal kezel E.coli HB101 (14) tartalmaz 10 mM MgCk, 10 CaCk és 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) összetételű oldatban. Az elegyet 20 percen át jégben hűtjük, 1 percre 42 °C-ra melegítjük és 10 percen át 20 °C-on inkubáljuk. 1 ml Trypton-táptalajt (a Trypton-táptalaj 10 g Bacto-Tryptont) (Difco); 1 g élesztókivonatot (Dif— co); 1 g glükózt; (8 g NaCl-t és 294 mg CaCh-t tartalmaz 1 1 desztillált vízben) adunk hozzá és az elegyet 30 percen át 37 °C-on rázás közben, 300 f/p, inkubáljuk. Az elegyet két, 50 Mg/ml ampicillinnel (Sigma) kiegészített agarlemezre (McConkey agar, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 24
