202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
45 HU 202288 B 46 Difco; 0,6 ml/lap) visszük fel. A lemezeket 12-17 órán ét 37 °C-on inkubéljuk. 10 különböző kolónia plazmid-DNS-ét a következőképpen izoláljuk: A kolóniákat 10 ml, 50 Mg/ml ampicillinnel kiegészített Trypton-táptalajba oltjuk, mint fent, egy 25 ml-es Erlenmeyer lombikban. A kultúrákat 15-18 órán át 37 °C-on és 300 f/p-cel rázzuk. A sejteket centrifugálással (Sorval, HS-4 rotor, 10 perc, 4000 f/p, 4 °C) gyűjtjük össze. Kb. 0,1 g sejtet kapunk és ezt 1 ml 50 mM Tris.HCl-ben (pH == 8,0) újraszuszpendáljuk. 0,25 lizozimoldatot (10 mg/ml 50 mM Tris.HCl-ben (pH = 8,0); a lizozimot a Sigma hozza forgalomba] adunk hozzá és 0 °C-on való 10 perces inkubáláB után 0,15 ml 0,5 M EDTA-t (pH = 7,5) adunk hozzá. További 10 perces 0 °C-on való inkubálás után 60 jul 2X-os Triton X-100-at (Merck) adunk hozzá. 0 °C-on való 30 perces állás után a mintát 30 percen át 4 °C-on 15000 f/p-n Sorvas SA-600 rotorban centrifugáljuk. A felülúszót 1 térfogat fenollal (telitett TNE-re) fehérje mentesítjük. A fázisokat 10 percen át 5000 f/p-n 4 °C-on végzett centrifugálással (Sorval HB-4 rotor) választjuk szét. A felső fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. 25 Mg/ml végkoncentráció eléréséig hasnyálmirigy RN-ázt (Singma; 10 mg/ml TNE-ben 10 percig 85 °C-on elömelegitve) adunk hozzá és az elegyet 40 percen át 37 °C-on inkubáljuk. Az oldatot utána 1 M NaCl-ra és 10X polietilénglikol 6000-re (Fluka, 20 percig 120 °C-on autoklávban kezelt) állítjuk és két órán át -10 °C-on inkubáljuk. A csapadékot Sorval HB-4 rotorban (20 perc, 10 000 f/p, 0 °C) gyűjtjük és újból 100 ul TNE-ben oldjuk. A DNS-oldatot 1 térfogat fenollal extraháljuk és a DNS-t 2 térfogat etanollal 10 percen át -80 °C-on kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf-centrifugában történő centrifugálással gyűjtjük és a DNS-t 20 m1 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) és 0,5 mM EDTA összetételű oldatban ismét oldjuk. 10 ml kultúrából 8-10 Mg plazmid-DNS-t kapunk. A plazmid-DNS-eket a kővetkező restrikciós enzimekkel megemésztve analizáljuk: 0,5-0,5 Mg plazmid-DNS-t Hpal-gyel (Biolabs) valamint Hpal-gyel (Biolabs) és EcoRI-gyel (Biolabs), Clal-gyel (Biolabs) az enzimgyártó adatainak megfelelő szabvány előírás szerint hasítunk. A DNS-eket 1X-06 agarózgélen 40 mM Tris.Acetát (pH = 7,8) 1 mM EDTA és 0,5 Mg/ml etidium-bromid összetételű oldatban frakcionáljuk. A kívánt plazmidok egy Hpal-helyet tartalmaznak és a háromszori emésztés után a nagy DNS-fragment mellett 2 kisebb fragmentet eredményeznek, amelyek nagyobbak, mint a pBR322 kis EcoRI-Clal-fragmentje. Ezeknek a plazmidoknak az egyikét pl59-cel jelöljük (lásd 9. ábra). B. A pHRH45 plazmid megszerkesztése 2 Mg pl59-DNS-t 10 egység EcoRI-gyel (Biolabs) 30 percen át 37 °C-on emésztünk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és centrifugálás után 10 m1 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az EcoRI-gyel emésztett DNS-t ezután 15 percen át 12 °C-on 5 egység DNS-polimerázzal (Klenow-f ragmens) (Boehringer) kezeljük 10 mM MgCh, 10 mM 0-merkapto-etanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (PÁL Biochemicals) 0,1 mM dTTP (PAL Biochemicals) összetételű oldatban. A polimerázt 5 perces 85 °C-on való inkubálással inaktiváljuk. A reakcióelegyet 20 mM Tris.HCl (pH = 7,8), 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) összetételű oldatban tízszeresre hígítjuk és reakcióelegy pl-ként 30 egység T< DNS-ligózzal 1 órán át 15 °C-on inkubáljuk. 50 ng DNS-sel E.coli-t transzformálunk (a fenti módon) és 50 Mg/ml ampicillinnel kiegészített McConkey-agarlemezekre visszük. 10 különböző kolóniából a fenti módon izoláljuk a plazmid-DNS-t. A plazmid-DNS-eket EcoRI-gyel való emésztéssel analizáljuk. A kívánt plazmidok EcoRI-rezisztensek. Az analízist a fent leírt módon végezzük. A kívánt plazmidok egyikét HR145-tel jelöljük. (9. ábra). C. A pHRH48 plazmid megszerkesztése 2 Mg pHRil45 DNS-t 5 egység Clal-gyel (Boehringer) 60 percen ét 37 °C-on kezelünk, majd fenolos extrakcióval fehér jementesitjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és utána 20 Ml 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5), 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. Az elálló végeket a fenti módon DNS-polimeráz I (Klenow-fragmens)-el feltöltjük, azzal a változtatással, hogy dATP és dTTP helyett dCTP-t (PÁL Biochemicals) és dGTP-t (PÁL Biochemicals) alkalmazunk. A polimerázt 5 perces melegítéssel 85 °C-on inaktiváljuk. A reakcióelegyet 2 térfogat 0,1 M Tris.HCl-lel (pH = 8,7) elegyítjük és 0,5 egyBég borjú foszfatázzal (Boehringer) 30 percen át 37 °C-on inkubáljuk. A reakció elegyet fenolos extrakcióval fehérjementesitjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 8 /ul 10 mM Tris.HCl (pH = 7,5) 0,5 mM EDTA összetételű oldatban oldjuk. A kémiailag szintetizált 5 '-GAATTCCATGGTACCATGAATTC-3’ képletű linker-DNS-t az 5’-végen foszforiláljuk oly módon, hogy 8 pmól linkért 5 uCi (yMP)-ATP-vel (5500 Ci-mmól-1 Araersham) inkubálunk 30 percen át 37 °C-on 8 /ul reakciótérfogatban, amely 0,1 mM KATP-t (Sigma), 50 mM Tris.HCl-t (pH = 9,5), 10 mM MgCh-t, 5 mM DTT-t és 2 egység polinukleotid-kinázt (PÁL Biochemicals) tartalmaz. A reakciót -80 °C-on való befagyasztással állítjuk le. A radioaktív jelzett linkért utána 1 Mg Clal-gyel és foszfatázzal kezeljük és pHRi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
