202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
3 HU 202288 B 4 (1) pozitívan befolyásolja a fehérjék biológiai aktivitását (2) szabályozós alatt álló sejtfolyamatokban vesz részt (amint az a reverzibilis foszforilálás esetében ismert). (3) stimulálja a szekréciót, azaz a szulfatálós a szekréciós fehérje felismerési jeleként szolgál: minden ismert szulfátéit fehérje elválasztást fokozó vagy transzmembrán fehérje. Meglepő módon aat találtuk, hogy az elméleti feltevéssel ellentétben a hirudin értékes biológiai tulajdonságai akkor is megmaradnak, ha a Tyr^-csoport fenolos hidroxiljáról eltávolítjuk a jellemző szulfát-monoészter csoportot. A találmány szerinti transzformált mikroorganizmusok segítségével előállított szulfátcsoportot nem tartalmazó (.deszulfatohirudin') hirudinszármazékok biológiai hatása, különösen alvadásgátló hatása, minőségileg és mennyiségileg legalább egyenértékű a természetes hirudinéval. A következőkben a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák és gének alatt olyan DNS-szekvenciák és gének értendők, amelyek az expresszióban olyan hirudinhoz hasonló polipeptideket eredményeznek, amelyek a természetes hirudintól különösen a tirozin-63-ról hiányzó szulfátcsoportban különböznek (.deszulfatohirudin"). A hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák előállítása A találmány a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciákra és ezek fragmenseire vonatkozik. A találmány továbbá eljárás a hirudin aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák és azok fragmenseinek előállítására úgy, hogy a piócagenomból izoláljuk a hirudin strukturgént, vagy a hirudin-m-RNS-ről komplementer kettős szálú DNS-t (hirudin ds cDNS) készítünk, vagy a hirudin-gént vagy annak fragmen6eit kémiai és enzimatikus eljárásokkal állítjuk elő. A genomból származó hirudin-DNS-t és a hirudin-ds-cDNS-t önmagában ismert módszerekkel kapjuk. Így a hirudingént pióca génbankból származó piócagenomból kapjuk oly módon, hogy a pióca DNS-fragmenseket mikroorganizmusban klónozzuk és a hirudin-DNS-t tartalmazó kiónokat például kolónia-hibridizálással azonosítjuk, amihez olyan radioaktív jelzett hirudin-DNS specifikus oligodezoxinukleotidot alkalmazunk, amely legalább 15, előnyösen 15-30 dezoxinukleotidot tartalmaz. Az így kapott DNS-fragmensek a hirudin-gén mellett rendszerint még további nem kívánt DNS-Bzakaszokat tartalmaznak, amiket megfelelő exo- vagy endonukleázos kezeléssel hasíthatunk le. A kettős szálú hirudin-cDNS-t például oly módon állíthatjuk elő, hogy alkalmas, előnyösen hidrudinképzés céljából indukált piócasejtekból mRNS-t izolálunk, a kapott mRNS-keveréket önmagában ismert módon hirudin-mRNS-re nézve dúsítjuk, ezt az mRNS-t templátként alkalmazzuk az egyfonalas cDNS előállításához, amiből RNS-függó DNS-polimeráz segítségévei kettős szálú cDNS-t szintetizálunk és ezt alkalmas vektorban klónozzuk. A hirudin cDNS-t tartalmazó kiónokat például a fenti módon telep-hibridizálással, radioaktív jelzett hirudin-DNS specifikus oligodezoxinukleotidok alkalmazásával azonosítjuk. A genomból ily módon kapott hirudin-DNS-t vagy a hirudin cDNS-t előnyösen az 5’- és 3’-végen olyan kémiailag szintetizált adapter-oligode zoxin u kleotidokkal kapc solj u k össze, amelyek egy vagy több különböző restrikciós endonukleáz felismerési szekvenciáit tartalmazzák és ezáltal az alkalmas vektorokba történő beépítést megkönnyítik. A hirudin-DNS, illetve -cDNS 5’-végéhez kapcsolt adaptermolekulának még kiegészitóleg tartalmaznia kell a transzláció startjelét (ATG). A transzláció startjele úgy helyezkedjen el, hogy ezt közvetlenül a hirudin első aminosavónak kodonja kövesse. Mivel a természetes hirudin-gén szerkezete nem ismeretes és a hirudin-aminosavszekvenciáját kódoló gén kémiai szintézise a modern szintézislehetőségek alapján, különösen az idő szempontjából, előnyökkel járt, utóbbi a találmány előnyös kiviteli formáját képezi. A deszulfatohirudin-gén kémiai szintézise A találmány eljárás különösen a deszulfatohirudin-gén vagy annak fragmentjei előállítására; a deszulfatohirudin-gén kódoló és komplementer szálának szegmenseit kémiailag szintetizáljuk és a kapott szegmenseket enzimatikusan deszulfatohirudin strukturgénné vagy annak fragmensévé alakítjuk. A találmány továbbá azokra a kettős szálú DNS-ekre vonatkozik, amelyek a deszulfatohirudint kódolják. A találmány szerinti DNS-ek a deszulfatohirudin kodonjain kivül tartalmazzák a transzláció start- és stop-jeleit, amik alkalmas gazdasejtben, például £. coli-ban az expressziót lehetővé teszik, továbbá a végeken olyan nukleotidszekvenciákat, amelyek vektorba való beépítésre alkalmasak. A találmány egyik előnyös kiviteli formája olyan DNS-re vonatkozik, amelyben az 5’-végen lévő, restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvenciákat a transzláció startjele, a hirudin kodonjait - amelyek adott esetben egy vagy több helyen restrikciós enzimmel való hasítást tesznek lehetővé - a transzláció stopjele és a 3’-végen restrikciós enzimmel hasítható nukleotidszekvencia követi. A találmány szerinti alkalmazható restrikciós enzimek például az Eco Rí, Eco 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
