202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
23 HÜ 202288 B 24 V jelentése Val. Például a találmány szerint előállítható N-terminális metionilcsoportot tartalmazó hirudinvegyületeket megfelelő N-terminális metionilcsoportot nem tartalmazó vegyületekké alakíthatjuk oly módon, hogy a terminális metionilcsoportot a szokásos módon bróm-cianiddal lehasítjuk. A bróm-cianidos reagáltatást például vizes-savas közegben, igy híg sósavban, például 0,1-0,3 N sósavban, vagy erős szerves savban, például 50- -70%-os hangyasavban, szobahőmérsékleten vagy kissé növelt vagy csökkentett hőmérsékleten, például 15-25 °C-on, 24 órán ét végezzük. Korábbi vizsgálatok megmutatták, hogy a természetes hirudin alvadásgátló aktivitása szempontjából a diszulfidhidak épségének jelentősége van (v.ö. 2 irod.). A gazdasejt megválasztásától függően nem zárható ki, hogy a primer transzlációs termékben a Hat ciszteincsoport összekapcsolódása a három diszulfidhiddá olyan módon történik, amely a természetes, a piócasejtben lejátszódó folyamattól különbözik. Lehetséges, hogy a termék kialakuló .hamis' tercier struktúrája az értékes farmakológiai tulajdonságok, különösen az alvadásgátló aktivitás csökkenéséhez, sót elvesztéséhez vezet, ami a fenti hirudin-tesztekkel (például trombin-teszt) megállapítható. Ilyen esetben célszerű a diszulfidkötéseket alkalmas redukálószerrel hasítani és a redukált polipeptidet a diszulfidkötések újbóli kialakítására alkalmas oxidálószerrel kezelni. A képződött termék hirudin-aktivitása (például a trombin-tesztben) alapján megállapítható, hogy a választott körülmények (redukáló- és/vagy oxidálószer) a kívánt biológiailag aktiv hirudinhoz vezettek-e vagy a körülményeket ismert módon módosítani kell. A diszulfidkötések felhasítására alkalmas redukálószerek például a tiolszármazékok, igy a tiofenol, 4-nitro-tiofenol, 1,4-butánditiol és különösen az 1,4-ditiotreitol. A redukciót előnyösen vizes-alkálikus közegben, például alkálifém-hidroxid, így nátrium-hidroxid, alkálifém-karbonát, például nátrium-karbonát, vagy szerves bázis, különösen tri(rövidszénláncú alkil)-amin híg vizes oldatában, szobahőmérsékleten végezzük. A redukált polipeptidben a diszulfidkötések újbóli összekapcsolására alkalmas oxidálószer a levegő oxigénje, amit a polipeptid vizes oldatán, amely adott esetben katalitikus mennyiségű átmenetifémsót, például vas-(III)-szulfátot, vas-(III)-kloridot vagy réz-(II)-szulfátot tartalmaz, vezetünk át; a jód, KJ3 kálium-jodid addukt formájában is, amit előnyösen alkoholos, például metanolos, vagy vizes-alkoholos, például vizes-metanolos oldat formájában alkalmazunk; káliumhexaciano-ferrát-(III) vizes oldatban; 1,2-dijód-etán vagy azo-dikarbonsav-dimetil-észter vagy -dietil-észter, amelyeket vízben vagy vízből és vízzel keveredő alkoholból, például metanolból álló elegyben viszünk reakcióba. Az oxidációt különösen szobahőmérsékleten végezzük. A reagensek, különösen a sók és az oxidáló- illetve redukálószerek és a belőlük képződött termékek elválasztása a kívánt hirudinvegyületektól önmagában ismert módszerekkel történik, pélául molekulasúly szerinti szűréssel, például Sephadex-en vagy Biogel-en. Az eljárás szerint előállítható hirudin-aktivitású vegyületek elegyét önmagában ismert módszerekkel választhatjuk szét az egyes komponensekre. Alkalmas elválasztási eljárás például valamilyen kromatográfiás eljárás, például az adszorpcióé kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, HPLC vagy fordított fázisú HPLC, továbbá a többszörös megoszlás vagy elektroforetikus módszerek, például elektroforézis cellulózacetáton vagy gélelektroforézis, különösen poliakrilamid-gélelektroforézis (.PAGE'). A találmány továbbá az előállítható új deszulfatohirudin-vegyületekre, különösen olyan (XIV) általános képletűekre, ahol a képletben V jelentése Met-Val és W jelentése megadott, és azok sóira vonatkozik. A találmány továbbá olyan deszulfatohirudin-vegyületekre vonatkozik, amelyeket RP-HPLC állandók [körülmények: Vydac 218- TP5415; 4,6 x 150 mm; átfolyási sebesség 1,2 ml/perc; eluens: A: 0,1% trifluor-ecetsav, B: acetonitril/viz 8:2+0,07% trifluor-ecetsav. Grádiens: 2 percig 16% B, utána 3 perc alatt 20% B-re növelni, majd 27 perc alatt 64% B-re növelni] FPLC állandók [körülmények: mono Q-oszlop (Pharmacia), 4,6 mm x 150 mm. A puffer: 20 mM Tris. HCl pH=7,5; B puffer: 20 mM Tris. HC1/1 M NaCl. Lineáris 6Ógrádiens: A: mig 9 ml 15% pufferrel eluálódik, 10,7 ml alatt 70% B puffer-re emelkedik) és UV-elnyelés (Shimedzu UV spektrométerrel /UV240-es típus/ felvéve) a kővetkezőképpen jellemeznek: A-vegyület: RP-HPLC, retenciós idő 16,83 perc; FPLC; elúció 390 mM NaCl koncentrációnál; UV (viz): x«ax = 275 nm; B vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 18,43 perc; C vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 19,6 perc; FPLC: elúció 420 mM NaCl koncentrációnál, D vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 20,6 perc; FPLC: elúció 460 mM NaCl koncentrációnál E vegyület: RP-HPLC: retenciós idő 21,53 perc; FPLC: elúció 500 mM NaCl koncentrációnál; UV (viz): Xwu = 273 nm; és elóállitási eljárásukra transzformált gazdatörzsek segítségével. A találmány szerint előállítható vegyületek, illetve az új (XIV) általános képletű vegyületek nemcsak szabad formában, hanem sóik, különösen farmakológiailag elfogadható sóik formájában is előfordulhatnak. Mivel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
