202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
25 HU 202288 B 26 több, szabad aminocsoportot tartalmazó aminosavmaradékkal rendelkeznek, a találmány szerinti vegyületek például savaddiciós sókat képezhetnek. Savaddiciós sóként különösen a szokásos terápiásán elviselhető savakkal képzett élettanilag elviselhető sók jönnek számításba; anorganikus savként a hidrogén-halogenidek (igy a hidrogén-klorid) de a kénsav és foszfor- illetve pirofoszforsav is említhető; a szerves savak közül elsősorban a szulfonsavak, igy a benzol- vagy p-toluolszulfonsav vagy rövidszénláncú alkánszulfonsavak, például metánszulfonsav, valamint karbonsavak, például ecetsav, tejsav* palmitin- és sztearinsav, almasav, borkősav, aszkorbinsav és citromsav alkalmasak. Mivel a hirudinvegyületek szabad karboxilcsoportokkal rendelkező aminosavmaradékokat is tartalmaznak, ezek fémsót, különösen alkálifémvagy alkáliföldfémsót, például nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnéziumsót vagy ammóniából vagy valamilyen élettanilag elviselhető, szerves nitrogéntartalmú bázisból levezetett ammóniumsót képezhetnek. Mivel egyidejűleg szabad karboxilcsoportokat és szabad karboxilcsoportokat és szabad aminocsoportokat tartalmaznak, belső sókat is képezhetnek. Az előállítás módjától függően a találmány szerinti vegyületeket szabad formában vagy savaddiciós sók vagy bázisokkal képzett sók formájában kapjuk. A savaddiciós sókból és a bázisokkal képzett sókból önmagában ismert módon, például a pH izoelektromos pontra való állításával kapjuk a szabad vegyületeket. Másfelől az utóbbiakat savakkal, illetve bázisokkal, például a fenti sókat képezókkel reagáltatva, majd bepárolva és liofilizálva terápiásán elviselhető savaddiciós sókat, illetve bázisokkal képezett sókat kapunk. Deszulfatohirudin elleni monoklonális antitestek és ilyen antitesteket tartalmazó teszt-kittek Az antitesteknek az a tulajdonsága, hogy specifikus antigéneket kötnek meg, a szervezeten kivül a gyakorlatban az antigének kvantitatív meghatározására (immun-assay) és tisztítására • (immun-affinitás-kromatográfia) alkalmazható. Immunizált állatok széruma rendesen nagyszámú különböző antitestet tartalmaz, amelyek ugyanazzal az antigénnel a különböző kötőhelyeken eltérő affinitással reagálnak, ráadásul más antigének elleni antitesteket is, amelyek az egyed korábbi tapasztalatait tükrözik. Az antitestek sikeres alkalmazása az antigének meghatározására és tisztítására azonban nagy specifitást és reprodukálhatóságot igényel. Ezeket a követelményeket teljesítő homogén antitestek a Köhler és Milstein (17) által leirt hibridoma-technikával hozzáférhetők. A technika elve az, hogy immunizált állatok antitestet kiválasztó B-limfocitáit, például a lépból, tumorsejtekkel ősszeolvasztjuk (.fuzionáljuk"). A képződött hibridomasejtek egyesi tik az osztódás általi korlátlan szaporodás képességét azzal a képességgel, hogy egységes tipusú antitestet képezzenek és válasszanak ki. Szelektív közegben - amelyben a nem fúzionált tumorsejtek elpusztulnak, a hibridomasejtek azonban szaporodnak - történő tenyésztéssel és alkalmas manipulációkkal kiónokat, azaz egyetlen hibridomasejtből levezetett és genetikailag azonos sejtpopulációkat kaphatunk és tenyészthetünk és a sejtek által termelt monoklonális antitesteket izolálhatjuk. A találmány deszulfatohirudin és hirudin elleni monoklonális antitestekre, ilyen antitesteket termelő hibridómasejtekre és előállítási eljárásukra vonatkozik. Előnyösek azok a hibridóma-sejtvonalak és az ezekből kiválasztott monoklonális antitestek, amelyek a deszulfatohirudinnal vagy hirudinnal specifikusan reagálnak. A találmány eljárás raonoklonális anti-deszulfatohirudin- és antihirudin-antitestek előállítására oly módon, hogy egereket deszulfatohirudinnal vagy hirudinnal immunizálunk, az ilyen módon immunizált állatok B-limfocitáit mielómasejtekkel fuzionáljuk, a képződött hibridómasejteket klónozzuk, majd in vitro vagy egérbe injektálva tenyésztjük és a kultúrákból antitestet izolálunk. A találmány további immun-affinitás-kromatográfiás oszlopokra és ezeket az antitesteket tartalmazó immun-assay kittekre vonatkozik. A találmány szerinti eljárással egereket, például Balb/c-egereket önmagában ismert módon immunizálunk. Meglepő módon az immunizálás sikerül, bár a deszulfatohirudin és hirudin viszonylag kis fehérjemolekulák. A találmány egyik előnyös kiviteli formájában a hirudint vagy deszulfatohirudint hetenként vagy több hét, például 5-12 hét alatt nagyobb időközökben injektáljuk, míg elegendő számú antitest-termelő B-limfocita képződik. Az immunizált egerek B-limfocitákat tartalmazó szerveit, például lépsejteket, kivesszük és olyan mielómasejtekkel egyesítjük, amelyek mutáció miatt szelektív tápközegben nem növekednek. Ilyen mielomasejtek ismeretesek például az X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.- 3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 vagy SP 2/0 jelzésűek. A találmány előnyös kiviteli formájában immunizált egerek lépsejtjeit X63- -Ag8.6.5.3 sejtvonal mielómasejtjeivel egyesítjük. A fúziót önmagában ismert eljárás szerint a B-limficiték és a mielomasejtek összekeverésével végezzük sejtfúziót kiváltó szer, például polietilénglikol, Sendai-virus, kalcium-klorid vagy lizolecitin hozzáadása közben. A fúzió előnyösen 1000 és 4000 molekulatömeg közt lévő polietilénglikol jelenlétében történik. A fúzió után a képződött hibrideket önmagában ismert eljárás szerint hipoxantin-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
