202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
1 HU 202288 B 2 A találmány tárgya eljárás a hirudin-trombin-inhibitor aminosavszekvenciáját kódoló DNS-szekvenciák, az ilyen DNS-szekvenciákat tartalmazó hibrid-vektorok, az ilyen hibridvektorokkal transzformált gazdasejtek, az ilyen transzformált gazdasejtekkel termelt trombin-inhibitor aktivitással rendelkező új polipeptidek, ezeknek a DNS-szekvenciáknak, hibridvektoroknak és transzformált gazdasej- Leknek az előállítására és a trombin-inhibitorok transzformált mikroorganizmusok segítségével történő előállítására. Az egészséges emlős szervezet plazmájában a fibrinolitikus rendszer és az alvadási rendszer között dinamikus egyensúly áll fenn, amely a működő érhálózatot fenntartja. Érsérülések esetében az alvadási rendszer fibrinmátrixot képez, arait a hemosztatikus állapot elérése után a fibrinolitikus rendszer ismét leépít. Azokban az esetekben, amikor a szervezet fibrinolitikus potenciálja nem elegendő a képződött intravascularis vérrögök lebontásához, például tromboemboliában vagy műtét utáni komplikációkban szenvedő betegeknél, elkerülhetetlen a szervezet trombolitikus vagy véralvadás elleni szerek adagolásával való segítése. A hagyományos véralvadás elleni terápiában eddig elsősorban heparint, továbbá 4- -hidroxi-kumarin- és 1,3-indandion-származékokat alkalmaztak. Bár ezekkel a szerekkel figyelemre méltó sikereket értek el, mégis van néhány hátrányuk. Így a heparin nem közvetlenül a véralvadási folyamatra hat, hanem alvadásgátló hatását közvetve fejti ki az antitrombin III-on keresztül a trombin és az X faktor gátlásának gyorsítása révén. A szervezetben a heparin továbbá számos nem specifikus reakcióban vesz részt és a vérlemezke-faktor 4 semlegesíti, ami a diffúz intravascularis koagulopatiaban, illetve a diszszeminált intravasalis alvadásban (DIC) való alkalmazhatóságát csökkenti. Az alvadás elleni terápiában ezért szükség van alternativ és specifikusabb szerekre. Régóta ismert az orvosi piócában (Hirudo medicinalis) előforduló természetes alvadásgátló, a hirudin. A hirudin 65 aminosavból álló, teljesen tisztázott szerkezetű (1) polipeptid, amelynek szerkezeti jellegzetessége az N-terminálison a hidrofób-aminosavak, a C-terminálison a poláros aminosavak felhalmozódása, szulfát-monoészter formájában előforduló tirozincsoport (Tyr63) és három diszulfidhid, amelyek pontos elrendeződése azonban még nem ismeretes. A hirudin Ki-értéke (komplex disszociációé állandó) 6-10*11 M, amivel a legerősebb ismert trombin-inhibitor, és specifikus trombinaffinitás jellemzi; a véralvadási rendszer többi enzimét nem gátolja. A heparinnal ellentétben a hirudin közvetlenül fejti ki gátló hatását a trombinra és nem antitrombin III— -on keresztül, mint a heparin. A tisztított hirudin egyetlen farmakológiailag kimutatható hatása a véralvadás gátlása, illetve a trombózis profilaxisa. Intravénás adagolásban kutyákon még nagy dózisok alkalmazása mellett sem figyelhető meg a szívverés frekvenciájára, légzésre, vérnyomásra, trombocitaszámra, fibrinogénra és hemoglobinra kifejtett hatás. Patkányon, disznón és kutyán végzett kísérletekben a hirudin hatásosnak bizonyult kísérletes trombózisban (amit statis-szal vagy trombin injekcióval idéztek elő), endotoxin sokkban és DIC-ben (disszeminált intravasalis alvadás). Közvetlen összehasonlító kísérletekben, bárhol végezték is azokat, a hirudin erősebb hatást fejtett ki, mint a heparin. Bár a hirudin már régóta ismert, eddig még nem nyert olyan széleskörű alkalmazást, amit kiváló biológiai tulajdonságai alapján várnánk. A gyógyászatban való általános alkalmazásának ugyanis útjában áll rendkívül korlátozott hozzáférhetősége. Mostanáig a hirudin készítményeket kizárólag drága és nehezen hozzáférhető természetes anyagból, orvosi pióca kivonatokból kiindulva időigényes és költséges izolálási és tisztítási eljárásokkal kapták (v.ö. 2. hivatkozás). A 65 aminosavat tartalmazó viszonylag hosszú szekvencia miatt gazdaságossági szempontból a klasszikus peptidszintézis sem kecsegtetett sikerrel. Elegendő mennyiségű hirudin előállításához, amely a terápiás potenciáljának megállapításához szükséges részletes klinikai vizsgálatokat és a véralvadás elleni terápiában való széleskörű alkalmazást lehetővé teszi, új utakat kell keresni. Erre különösen alkalmas a rekombináns DNS-technológia. Segítségével előállithatók a legkülönbözőbb fiziológiai aktivitású polipeptidek, megfelelő genetikailag módosított mikroorganizmusok tenyésztésével vagy emlőssejt-kultúrákkal. A találmány célja az, hogy géntechnológiai eszközök segítségével olyan expressziós rendszert bocsásson rendelkezésünkre, ami a hirudin aktivitású polipeptidek mikrobiológiai előállítását ipari méretben lehetővé teszi. Ezt a feladatot a találmány a hirudin-gént tartalmazó hibridvektorok elkészitésével oldja meg, amiket azután egy expressziós kontrollszekvencia oly módon szabályoz, hogy a hibridvektorokkal transzformált gazdasejtben a hirudin aktivitású polipeptid kifejeződik. Várható, hogy a transzformált gazdasejtekben (transzformált piócasejtek kivételével) az ilyen DNS-szekvenciák expressziója kiegészitóleg beépített szulfátátvivő enzimrendszer hiányában olyan terméket eredményez, amelyet a természetes hirudintól lényegében csak a tirozin-63-ról hiányzó szulfátcsoport különböztet meg. A szulfátcsoport biológiai szerepe a fehérjékben általában és különösen a hirudinban még részletesen nem tisztázott, mindenesetre a jelenlegi ismeretek szerint a szulfátcsoport nem kis mértékben befolyásolja a fehérjék fizológiai tulajdonságait. A szulfátcsoport a következő hatásokat fejtheti ki: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
