202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 202287 B 2 (138 ng) illetőleg 1500 feletti bázis-párral (204 ng). Mindkét méretű cDNS frakcióból egy-egy 35 ng-nyi részt dezoxiC maradékkal hosszabbítottunk meg terminális dezoxinukleotidil-transzferáz (40) alkalmazásával és a PstI helyen hasonló módon dezoxiG maradékkal meghosszabbított pBR322 plazmiddal (300 ng) kezeltük őket (41). Mindkét ily módon kezelt elegyet azután E. coli K12 294-törzsbe transzformáltuk. Megközelítőleg 8000 transzformánst kaptunk a 800-1500 bp cDNS frakcióval és 400 transformánst az 1500 feletti bp cDNS frakcióval. E. A kolónia-könyvtárak szűrővizsgálata indukált cDNS-re Az egyes kolóniákat külön-külön beoltottuk mikrotiter-lemezek LB (58) mellett 5 pg/ml tetraciklint tartalmazó mélyedéseibe és dimetil-szulfoxid 7% koncentrációig történő hozzáadása után -20 °C hőmérsékleten tároltuk a lemezeket. A kolónia-könyvtár két kópiáját hagytuk kifejlődni nitrocellulóz szűrőkön, majd mindegyik kolóniából a DNS-t Grunstein-Hogness (42) módszere szerint rögzítetük a szűrőhöz. Indukált és indukálatlan PBL tenyészetekből 32P- vel jelzett cDNS próbákat készítettünk ezután, gélen frakciónak 18S mRNS felhasználásával. Oligo dTi2-i8 prímért alkalmaztunk és a reakciót a már leírt (1) körülmények között folytattuk le. A cDNS 600-1500 bp méretű frakcióiból kapott 8000 transzformánst, valamint cDNS 1500 bp méretű frakcióiból kapott 400 transzformánst tartalmazó szűrőket 20x106 cpm indukált 32P-cDNS-sel hibridizáltuk. Egy hasonló módon elkészített párhuzamos szűrő-sorozatot 20x10^ cpm indukálatlan 32P-cDNS-sel hibridizáltunk. A hibridizálást 16 óra hosszat folytattuk a Fritsch és munkatársai (43) által leírt körülmények között. A szűrőket ezután alaposan mostuk (43) majd 16-48 órai időtartamra Kodak XR-5 röntgen-filmre helyeztük őket Dupont „Lightning-plus” erősítő szűrő alkalmazásával. Mindegyik kolónia esetében összehasonlítottuk egymással a két próbával kapott hibridizáció- képet. A kolóniák körülbelül 40%-a tisztán megállapíthatóan hibridizált mindkét próbával, míg a kolóniák körülbelül 50%-a a szondák egyikével nem mutatott hibridizációt (lásd 3. ábra). 124 kolónia szignifikáns módon hibridizált az indukált próbával, de nem volt kimutatható (vagy igen gyenge volt) hibridizációjuk az indukálatlan próbával. Ezeket a kolóniákat azután külön-külön inokuláltuk mikrotiter-lemezek mélyedéseibe, hagytuk kifejlődni őket, majd nitrocellulózszűrőkre vittük át és ugyanazzal a két próbával hibridizáltuk őket a fent leírt módon. Valamennyi ilyen kolóniából elkülönítettük a plazmid DNS-t egy ismert gyors módszer (44) alkalmazásával, ezt szintén nitrocellulóz-szűrőkhöz kötöttük és hibridizáltuk (45) az indukált illetőleg indukálatlan próbákkal. 22 kolóniából kapott DNS csupán az indukált próbával hibridizált; ezeket „indukált” kolóniákként jelöltük meg. F. Az indukált kolóniák jellemezése. Öt indukált kolóniából plazmid-DNS-t készítettünk (46) és ezt a cDNS betétek jellemzésére használtuk fel. Az 5 indukált plazmid (p67, p68, p69, p71 és p72) restrikciós endonukleáz-térképe azt mutatta, hogy ezek közül négy plazmidnak hasonló restrikciós nukleáz térképe volt. E négy plazmid (p67, p69, p71 és p72) egyaránt 4 DdeI helyet, 2 Hlnfl helyet és egyetlen Rsal helyet tartalmazott a cDNS inszertumban. Az 5. plazmid (p68) egy közönséges DdeI fragmenst tartalmazott és a másik négyhez viszonyítva rövid cDNS kiónnak látszott. A restrikciós nukleáztérképek által mutatott homológiát a hibridizáció eredménye is megerősített. A p67 plazmid egy 600 bp DdeI ffagmenséből egy 32P-vel jelzett DNS próbát készítettünk (47) és ezt a többi indukált kolónia hibridizálására (42) alkalmaztuk. Mind az öt restrikciós nukleázzal térképezett kolónia kereszt-hibridizációt mutatott ezzel a próbával, ugyanúgy mint az indukált/indukálatlan szűrővizsgálattal kapott 124 kolóniából kiválasztott 17 további kolónia mindegyike is. Az ezekben a kereszt-hibridizáló plazmidok mindegyikében lévő cDNS inszertum hosszúságát Pstl enzimes kezeléssel és gél-elektroforézissel határoztuk meg. Úgy találtuk, hogy a 69-es klón tartalmazza a leghosszabb cDNS inszertumot, ennek hossza 1200- 1400 bázis-pár volt. Az összes további kísérlethez ezt a DNS-t alkalmaztuk; restrikciós endonukleáztérképét a 4. ábra mutatja. A p69 cDNS-inszertuma nem más, mint az IFN-y cDNS, amely három egymástól független expressziós rendszerben termelődött és vírusellenes aktivitást mutat, amint ezt az alábbiakban részletesebben ismertetjük. G. A p69 cDNS-inszertumának szekvencia-analízise A p69 plazmid cDNS-inszertumának teljes nukleotid-szekvenciáját a didezoxinukleotid lánc-terminációs módszerrel (48) határoztuk meg fragmenseknek az M13 mp7-vektorba történő szubklónozása (49) után; meghatároztuk továbbá ezt a szekvenciát a Maxam-Gilbert-féle kémiai eljárással (52) is. A leghossazbb nyílt leolvasó-fázis egy 166 aminosavból álló fehérjét kódol; ezt az 5. ábra szemlélteti. Az első kódolt maradék a cDNS 5’-végén elsőnek talált metkodon. Az amino-végen álló első 20 maradék valószínűleg szignál-szekvenciául szolgál a fennmaradó 146 aminosav szekréciójához. Ez a feltételezett szignál-szekvencia olyan vonásokat mutat - mint a méret és a hidrofobitás - amelyek közösek más már jellemzett szignál-szekvenciák megfelelő vonásaival. Emellett a feltételezett hasítási szekvenciánál talált négy aminosav (ser-leu-gly-cys) azonos több leukocita- interferon, mint a LelF B, C, D, F és H (2) hasítási pontjánál levő négy maradékkal. A kódolt érett, 146 aminosavat tartalmazó szekvencia (a továbbiakban „rekombináns humán immuninterferon”) molekulatömege 17140. A kódolt fehérje-szekvenciában két lehetséges glikozilezési hely (50) van, a 28-30 aminosavaknál (asn-gly-thr) és a 100-102 aminosavaknál (asn-tyrser). E helyek létezése összhangban áll a humán-y megfigyelt glikozileződésével (6, 51). Emellett a jelenlevő összesen két cisztein-maradék (az 1- és 3- helyzetben) szférikusán túlságosan közel van egymáshoz, hogy diszulfid-hidat képezhessen, ami szintén összhangban áll az IFN-y redukálószerek, mint ßmerkapto-etanol jelenlétében megfigyelt stabilitásával (51). A levezetett érett aminosav-szekvencia általában eléggé bázikus, 30 összes lizin-, arginin- és hiszti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
