202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 202287 B 2 din-maradékkal és csupán 19 összes aszparaginsav- és glutaminsav-maradékkal. A p69 plazmid DNS-szekvenciájából levezethetöen az IFN-y mRNS-jének szerkezete határozottan eltér az EFN-a (1, 2) illetőleg IFN-ß (5) mRNS-jének szerkezetétől. Amint ezt a 6. ábra szemlélteti, az IFN-y kódolási tartománya rövidebb, míg az S’-lefordítatlan és 3’-lefordítatlan tartományok jóval hosszabbak, mint akár az IFN-a, akár az IFN-ß megfelelő tartományai. H. Rekombináns humán immuninterferon kifejeződése E. coli-ban Amint a 7. ábra szemlélteti, 50 pg p69 plazmidot PstI enzimmel kezeltünk, majd az 1250 bázispárt tartalamzó inszertumot 6%-os poliakrilamid-gélen lefolytatott gélelektroforézissel különítettük el. Körülbelül 10 pg ilyen inszertumot elektroelúció útján nyertünk ki a gélből. 5 pg ilyen Pstl fragmenst 3 egység BstNl enzimmel (Bethesda Research Labs) 15 percig kezeltünk 37 °C hőmérsékleten részlegesen lebontás céljából, majd a reakcióelegyet 6%-os poliakrilamid-gélen tisztítottuk. Körülbelül 0,5 pg mennyiségben nyertük ki a kívánt, 1100 bázispárt tartalmazó BstNl-Pstl fragmenst. A két említett dezoxioligonukleotidet 5 ’-dAATTCATGTGTTATTGTC és 5’-dTGACAATAACACATG (7. ábra) - a foszfotriészter-módszerrel (53) szintetizáltuk, majd az alábbi módon foszforileztük őket: mindkét dezoxioligonukleotidből 100 pmól mennyiséget egyesítettünk egymással 30 pl 60 mmól/1 trisz-HCl (pH-8), 10 mmól/1 magnézium-klorid, 15 mmól/1 ß-merkaptoetanol és 240 pCi (y-32P)ATP (Amersham, 5000 Ci/mmól) tartalmú elegyben. Ehhez az elegyhez azután 12 egység T4 polinukleotid- kinázt adtunk és az elegyet 30 percig hagytuk reagálni 37 °C hőmérsékleten. Ezt követően 1 pl 10 mmól/1 ATP-oldatot adtunk hozzá és az elegyet további 20 percig hagytuk reagálni. Fenollal és kloroformmal történő extrakció után a kapott oligomereket a BstNl-Pstl 1100 bázispárt tartalmazó fragmens 0,25 pg-jával elegyítettük és etanollal lecsaptuk. Az így kapott fragmenseket 20 mmól/1 trisz-HCl (pH=7,5), 10 mmól/1 magnézium-klorid, 10 mmól/1 ditio-treitol, 0,5 mmól/1 ATP és 10 egység T4 DNS-ligáz tartalmú oldat 30 pl-jével 2 óra hosszat kezeltük 20 °C hőmérsékleten. Az elegyet azután a kohezív végek kapcsolódása révén fellépő polimerizáció kiküszöbölése céljából 1 óra hosszat kezeltüók 31 egység Pstl és 31 egység EcoRl enzimmel, majd 6%-os poliakrilamid-gélen történő elektroforézisnek vetettük alá. Az 1115 bázispárt tartalmazó terméket (110 000 cpm) elektroelúció útján nyertük ki. A pLelF A trp 103 plazmid (7. ábra) a pLelF A 25 plazmid (1) olyan származéka, amelyből a LelF A génhez távoleső EcoRI-helyet eltávolítottuk (27). 3 pg pLelF A trp 103 plazmidot 20 egység EcoRl és 20 egység Esti enzimmel kezeltünk 90 percig 37 °C hőmérsékleten, majci 6%-os poliakrilamid-gélen elektroforizáltuk. A nagy (körülbelül 3900 bázispárt tartalmazó) vektor-fragmenst elektroelúció útján nyertük ki. Az 1115 bázispárt tartalmazó EcoRI-Ps/I IFN-y DNS-fragmentet 0,15 pg fenti módon előállított vektorba kapcsoltuk. Az E. coli K-12 294 törzs (ATCC 31 446 sz.) transzformációja 120 tetraciklinrezisztens kolóniát eredményezett. Plazmid DNS-t állítottunk elő 60 fenti módon kapott transzformánsból, majd ezeket EcoRl és E.s/1 enzimmel kezeltük. Az így kapott plazmidokból három tartalmazta a kívánt 1115 bázispárból álló EcoRI-Es/I fragmenst. A DNS szekvencia-analízise igazolta, hogy ezeknek a plazmidoknak a kívánt nukleotid- szekvenciájuk van a trp promoter, szintetikus DNS és cDNS közötti kapcsolódási helyeknél. A további vizsgálatokhoz e plazmidok egyikét, a pIFN-y trp 48 plazmidot választottuk. Ezt aplazmidot használtuk föl az E. coli K-12 W3110 törzs (ATCC 27 325 sz.) transzformálására. I. Az IFN-y-kódoló szekvencia génszerkezete Az IFN-y-t kódoló gén szerkezetét a Southem-féle hibridizációs módszerrel vizsgáltuk. E módszer (54) szerint 5 pg nagy molekulatömegű humán limfocita DNS-t [amelyet az irodalomban (55) leírt módon állítottunk elő] különböző restrikciós endonukleázokkal kezeltünk az emésztés befejezéséig, majd 1,0%-os agaróz-gélen (56) elektroforézisnek vetettük alá és nitrocellulóz-szűrűre (54) itattuk fel a terméket. A p69 cDNS-inszertumának 600 bázispárt tartalmazó DdeI ffagmentjéből egy 32P-jelzett DNS-próbát állítottunk elő (47) és ezt a fenti nitrocellulóz-DNS készítménnyel hibridizáltuk (43). A próba 107 cpm/percet számláló mintáját 16 óra hosszat hibridizáltuk, majd az irodalomban (43) leírt módon mostuk. Különböző humán donorokból származó 8 genomos DNS-mintát az EcoRl restrikciós endonukleázzal kezeltünk, majd ezeket is hibridizáltuk a p69 32P-jelzett szondával. Amint ezt a 9. ábrán szemléltetjük, két tiszta hibridizácós szignál volt megfigyelhető, amelyek mérete 8,8 kilo-bázispár (kbp). illetőleg 2.0 kbp volt (a HindUl enzimmel kezelt /.DNS mobilitásával való összehasonlítás alapján becsült értékek). Ez az eredmény vagy két IFN-y géntől, vagy pedig egyetlen, egy EcoRl hely által hasított géntől származhat. Minthogy a p69 cDNS nem tartalmaz EcoRl helyet, egy belső EcoRl helyet tartalmazó közbelépő (intron) szekvenciára volna szükség ahhoz, hogy egyetlen gén feltételezésével magyarázzuk meg a fenti eredményt. Abból a célból, hogy a fenti két lehetőség között különbséget tehessünk, egy további Southem-féle hibridizációt végeztünk ugyanazzal a szondával, egyetlen humán DNS 5 további endonukleázos emésztési termékével (10. ábra). Két hibridizáló DNS-fragmentet kaptunk két további endonukleázos emésztési termékből: Pvull (6,7 kbp és 4,0 kbp) és HincU (2,5 kbp és 2,2 kbp). Három endonukleázos emésztés adott csupán egyetlen hibridizáló DNS-fragmenst, Hindlll (9,0 kbp), Bgtll (11,5 kbp) és BamHl (9,5 kbp). Két IFN-y gént kellett volna kapcsolni szokatlanul kis távolságra egymástól (kevesebb, mint 9.0 kbp) ahhoz, hogy ezek ugyanabban a Hindlll hibridizáló fragmentben foglaljanak helyet. Ez az eredmény arra mutat, hogy csupán egyetlen homológ IFN-y gén (számos rokon IFN-a géntől eltérően) van jelen a humán genomiális DNS-ben és hogy ezt a gént egy vagy több, EcoRl, Pvull és HincU helyeket tartalmazó intron hasítja. Ezt a feltevést támogatja az a hibridizációs kísérlet is, amelyet éppen a p69 cDNS 3’-lefordítatlan tartományából készített 32P-jelzett (47) fragmenssel (103 bp Ddel fragment 860 bp-től 990 bp-ig az 5. ábrán) végeztünk egy humán 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
