202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 Mindezeket a kísérleteket a jelen találmányt megelőző időben meglehetősen nyers készítményekkel kellett lefolytatni az immuninterferon ilyen nehéz hozzáférhetősége miatt. Eredményeik azonban kétségtelenül az immuninterferon rendkívül fontos biológiai szerepére mutatnak. Az immuninterferonnak nem csak erős vírus-ellenes hatása van, hanem valószínűleg erős immun- szabályozó és tumor-ellenes hatása is, ami határozottan az immuninterferon eredményes klinikai alkalmazásának a lehetőségére mutat. Úgy találtuk, hogy a rekombináns DNS-technológia alkalmazása látszik a leghatékonyabb módszernek a humán immuninterferon szükséges nagyobb mennyiségeinek az előállítására. Feltételeztük, hogy az így kapott termékek, akár glikozilezettek lesznek akár nem (a glikozilezettséget a natív, humán eredetű termék jellemző tulajdonságának tartják), minden esetre mutatni fognak olyan bioaktivitást, ami lehetővé teszi klinikai alkalmazásukat a vírusos, neoplasztikus és immun-szuppresszált állapotok és megbetegedések széles körében. B. Rekombináns DNS-technológia A rekombináns DNS-technlógia ma már igen kifinomult módszerré fejlődött. A molekuláris biológia kutatói már viszonylag könnyen tudnak különböző DNS-szekvenciákat rekombinálni, így új DNS-féleségeket hoznak létre, amelyek bőséges mennyiségben termelnek exogén fehérje-termékeket a transzformált mikroorganizmusokban. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek különböző tompavégű vagy „ragadós” végű DNS-fragmensek in vitro kapcsolására és így hatékony expresszió-hordozókat állítanak elő, amelyek bizonyos mikroorganizmusok transzformálására használhatók és ezzel irányítani tudják a kívánt exogen termék szintézisét. Az egyedi termékek termelésére irányuló utak azonban még meglehetősen tekervényesek és így ez a tudomány még nem fejlődött olyan fokra, hogy a kívánt siker rendszeresen előre megjósolható legyen. Valójában azok, akik kísérleti megalapozás nélkül akarják adott esetben a módszer alkalmazásának sikeres eredményét előre megjósolni, ezt csak a sikertelen gyakorlati alkalmazás kockázatával tehetik. A plazmid, ez a kettős-szálú DNS nem-kromoszóma hurok-képződménye, amely a baktériumokban és egyéb mikroorganizmusokban, sejtenként gyakran többszörös másolatban is található, továbbra is a rekombináns DNS-technológia alapvető eleme marad. A plazmid-DNS-ben kódolt információ magába foglalja a plazmidnak a leány-sejtekben történő reprodukálásához szükséges információt (vagyis a replikádé eredetét) is, valamint rendszerint egy vagy több fenotípusos szelekciós jellemzőt, mint például baktériumok esetében az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, ami lehetővé teszi a kérdéses plazmidot tartalmazó gazdasejt kiónjainak felismerését és szelektív közegekben történő kedvezőbb szaporítását. A plazmidok hasznossága abból a tényből ered, hogy ezek a plazmidok az egyik vagy másik resztrikciós endonukleáz vagy „resztrikciós enzim” segítségével specifikusan hasíthatók, mert ezeknek az enzimeknek mindegyike más és más helyet „ismer fel” a plazmid-DNS-en. Ezt követően heterológ gének vagy gén-fragmensek illeszthetők be a plazmidba, e fragmensek végeinek a hasítási helynél vagy a hasítási hellyel szomszédos rekonstruált végeknél történő kapcsolása útján. így képezik az úgynevezett replikálható expresszió-hordozókat. A DNS-rekombináció a sejten kívül megy végbe, de a keletkező „rekombináns” replikálható expresszió-hordozó vagy plazmid a „transzformáció” néven ismert eljárással bevihető a sejtekbe és a transzformáns tenyésztése útján a rekombináns hordozó nagy mennyigei nyerhetők. Emellett, ha a gén beillesztése a plazmidnak bekódolt DNS-üzenet transzkripcióját és transzlációját irányító részeihez viszonyítva helyesen történt akkor az így kapott expresszió-hordozó felhasználható a beillesztett gén által kódolt polipeptid-szekvencia tényleges termelésére; ezt az eljárást nevezik expressziónak. Az expresszió a „promoter” néven ismert és az RNS-polimeráz által felismert és kötött tartományban kezdődik. Az expresszió transzkripciós fázisában a DNS kitekeredik és hozzáférhetővé teszi az említett DNS-szekvenciából származó tartományt templátként a „messenger”-RNS iniciált szintézise számára. A messenger-RNS viszont az általa kódolt aminosavszekvenciájú polipeptiddé transzlálódik. Minden egyes aminosavat egy-egy nukleotid-triplett vagy „kodon” kódol, ezek a kodonok együttesen képezik a „szerkezeti gént”, vagyis azt a részt, amely kifejezett polipeptid-termék aminosav-szekvenciáját kódolja. A transzláció egy „start”-szignálnál kezdődik (ez rendszerint ATG, amelyből a képződő messenger-RNS-ben AUG lesz). A transzláció és egyúttal az aminosav képződés végét úgynevezett „stop”-kodon határozza meg. Az így keletkezett termék mikrobiális rendszerek esetében, ha szükséges, a gazdasejt lízise és a terméknek a jelenlevő egyéb fehérjéktől való elkülönítésére alkalmas tisztítási műveletek útján nyerhető ki. A gyakorlatban a rekombináns DNS-technológia útján teljesen heterológ polipeptidek expressziója - úgynevezett „direkt expresszió” - vagy pedig egy homológ peptid aminoisav-szekvenciájának egy részéhez kötött heterológ peptid expressziója válik lehetségessé. Ez utóbbi esetekben az előállítani kívánt bioaktív termék olykor bioinaktívvá válik az összekepcsolt homológ/heterológ polipeptidben és csak akkor lesz aktív, ha valamely sejten kívüli környezetben lehasítják; vö.: 2 007 676 A sz. brit szabadalmi közrebocsátási irat, továbbá Wetzerl; American Scientist 68, 664 (1980). C. Sejtkultúra-technológia A sejt- vagy szövetkultúráknak a genetikai és sejtfiziológiai tanulmányok céljaira történő tenyésztési módszerei jól ismertek. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek az elkülönített normális sejtekből folytatólagos sorozatos átvitelek útján előállított permanens sejtvonalak fenntartására. Az ilyen sejtvonalak kutatási célokra való fenntartása folyékony közegben tartott szilárd hordozón, vagy pedig a fenntartó tápanyagokat tartalmazó szuszpenzióban való tenyésztéssel történik. Ugylátszik, hogy a nagyméretben történő termelés céljaire való felnagyításhoz már csak mechanikai problémák merülnek fel. Az eddigi ismeretek további részleteire vonatkozólag utalunk a következő irodalomra: Microbiology, 2. kiad., Harper and Row Publishers Inc., Hagerstown, Maryland 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
