202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 (1973). Különösen az 1122 és köv. old., valamint Scientific American 245, 66. és köv. old. (1981). A találmány összefoglalása A jelen találmány azon a felismerésen alapul, hogy a rekombináns DNS-technológia sikeresen alkalmazható humán immuninterferon előnyösen közvetlen alakban és piacon való forgalmazás feltételéül szolgáló állatkísérletek és klinikai kísérletek elkezdéséhez és lefolytatásához elegendő mennyiségekben történő előállítására. A termék valamennyi alakjában alkalmazható embereknél vírusos fertőzések, malignus és immun-szupressziós vagy immun-hiányos állapotok megelőző vagy gyógyászati kezelésére. A termék említett alakjai sorába különféle lehetséges oligomer, esetleg glikozilezett alakok tartoznak. A terméket genetikailag átalakított transzformáns mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák termelik. így a találmány szerinti eljárással a humán immuninterferon az eddiginél hatékonyabb módon termelhető és nyerhető ki. A találmány előnyös kiviteli alakjának egyik jelentős vonása, hogy ezzel az eljárással a mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák genetikailag irányíthatók arra, hogy humán immuninterferont izolálható mennyiségekben termeljenek és az érett alakban válasszák ki a gazdasejtből. A találmány tárgya tehát elsősorban a humán immuninterferon előállítására szolgáló eljárás, amelynek részleteit az alábbiakban ismertetjük. A találmány körébe tartoznak továbbá a humán immuninterferont kódotó gén-szekvenciákat kifejezhető alakban magukban foglaló replikálható DNS expresszió-hordozók, valamint az említett expresszió-hordozókkal transzformált és humán immuninterferon termelésére képes mikroorganizmus-törzsek és sejtkultúrák, úgyszintén az ilyen immunínterferon génszekvenciák, DNS expresszió-hordozók, mikroorganizmus-törzsek és sejtkultúrák előállítására alkalmas különféle eljárások és azok specifikus kiviteli alakjai is. Vonatkozik továbbá a találmány az említett mikroorganizmusok és sejtkultúrák fermentációjára alkalmas kultúráinak előállítására, valamint humán immuninterferonnak a kultúrák gazdasejtjeiből érett alakban kiválasztott közvetlen expressziós termékként történő előállítására is. Ebben az eljárásban az érett szekvenciáját kódoló gén és a szignál-polipeptidet kódoló 5’-oldallánc-DNS kerülhet alkalmazásra. A szignál-polipeptid feltehetően elősegíti a molekulának a gazdaszervezet sejtfalához való vitelét, majd ott hasad le az érett humán immuninterferon termék kiválasztási folyamata alatt. Ily módon lehetővé válik a kívánt humán immuninterferon elkülönítése és tisztítása anélkül, hogy külön műveleteket kellene alkalmazni a gazdasejt intracelluláris fehérjéiből és sejt-törmelékekből álló szenynyezések eltávolítására. Az „érett humán immuninterferon” kifejezésen e leírásban a mikroorganizmusok vagy sejtkultúrák által termelt olyan humán immuninterferont értünk, amelyhez nem kapcsolódik a humán immuninterferonmRNS transzlációját közvetlenül elősegítő szignálpeptid vagy előszekvencia-peptid. így a jelen találmány szerinti eljárással előállított első rekombináns humán immuninterferon metionint tartalmaz első aminosavként (amely az ATG start-szignál kodonnak a szerkezeti gén elé történt beillesztése következtében került oda), vagy ha a metionin intra- vagy extracellulárisan lehasadt, akkor a rendes körülmények között első aminosavként szereplő cisztein áll ezen a helyen. Az érett humán immuninterferon - összhangban a fentiekkel - előállítható valamely, a szokásos szignál-peptidtől különböző konjugált pepiiddel együtt is; a konjugátum azután specifikusan lehasíthetó intra- vagy extracelluláris környezetben (vö.: 2 007 676 sz. brit szabadalmi közrebocsátási irat. Végül, előállítható az érett humán immuninterferon közvetlen expresszió útján is, anélkül, hogy bármilyen fölösleges kisérő polipeptidet kellene a termékről lehasítani. Ez különösen olyan esetekben fontos, amikor valamely adott gazdaszervezet nem képes eltávolítani a szignál-peptidet, az expresszió-hordozó viszont úgy van megalkotva, hogy az érett humán immuninteiferont szignál-peptidjével együtt. Az így termelt érett humán immuninterferont azután elkülönítjük és olyan mértékben tisztítjuk, hogy a kapott termék alkalmas legyen vírusos fertőzések malignu, immun-szupresszív vagy immun-hiányos állapotok gyógykezelésére. A humán immuninterferon előállítása az alábbi módon történt: 1. Emberi szöveteket, például emberilépszöveteket vagy perifériális vérlimfocitákat mitogén anyagok jelenlétében tenyésztettünk, az immuninterferon termelésének serkentése céljából. 2. Az ilyen sejtkultúrákból kapott sejtpasztillákat ribonukleáz- inhibitor jelenlétében extraháltuk, az öszszes citoplazmás RNS elkülönítése céljából. 3. Egy oligo-dT oszlopon elkölönítettük az összes messenger-RNS-t (mRNS) poliadenilezett alakban. Ezt az mRNS-t méret szerint frakcionáltuk, szacharózsűrűség-grádiens és savas karbamid gélelektroforézis alkalmazásával. 4. Az alkalmas mRNS-ffakciót (12-18 S) a megfelelő egyszálú komplementer DNS-sé (cDNS) alakítottuk át, majd ebből kettősszálú cDNS-t képeztünk. Poli-dC végrész-képzés után ezt egy vektorba, például valamely egy vagy több fenotípusos jelzőt (marker) hordozó plazmidba illesztettük be. 5. Az így készített vektorokat használtuk fel azután a baktérium- sejtek transzformálására és így egy kolónia-„könyvtárat” képeztünk. A fent leírt módon kapott indukált és indukálatlan mRNS-ből egyaránt radioaktívan jelzett cDNS-t állítottunk elő és ezt használtuk fel a duplikátum kolónia-„könyvtárak” külön-külön történő vizsgálatára. A cDNS feleslegét ezután eltávolítottuk és a kolóniákat röntgen filmre helyeztük az indukált cDNS-klónok azonosítása céljából. 6. Az indukált cDNS-klónokból elkülönítettük a megfelelő plazmid-DNS-t és szekvenáltuk. 7. A szekvenált DNS-t azután in vitro megfelelően elakítottuk egy alkalmas expresszió-hordozóba való beillesztésre, amelyet egy alkalmas gazdasejt transzformálására használtuk fel; ezt a gazdasejtet egy E. coli kultúrában szaporítottuk és hagytuk, hogy az kifejezze a kívánt humán interferon terméket. 8. A kifejezett humán immuninterferon érett alakjában kétségkívül 146 aminosavat tartalmaz, ciszteintől kezdődően, és igen bázisos jellegű. A monomer számított molekulatömege 17 140. A molekula talán 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
