202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 75%-a a 30% etilénglikolt tartalmazó pufferoldattal eluált frakciókban jelent meg. Ezeket a frakciókat egyesítettük és egy 20 mmól/1 nátrium-foszfátot és 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, pH-7,2 értékű pufferoldattal 10% etilénglikol-koncentrációra hígítót- 5 tűk és közvetlenül felvittük egy 10 ml Con A Sepharose adszorbenst (Pharmacia) tartalmazó oszlopra. Az oszlopot a 20 mmól/1 nátrium-foszfátot és 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, pH-7,2 értékű pufferral alaposan mostuk, majd az aktivitást a fentivel egyező, 10 de 0,2 mól/1 ct-metil-D-mannozidot is tartalmazó pufferoldattal eluáltuk. Az aktivitás számottevő része (55%) nem kötődött ehhez a lektinhez. Az aktivitás 45%-a eluálódott a-metil-D-mannoziddal. 15 Gyógyszerkészítmények A találmány szerinti eljárással előállított termékekből a szakmabeliek általjól ismert módszerekkel készíthetünk gyógyászati célokra felhasználható készítményeket; ennek során a találmány szerint előál- 20 lított humán immuninterferon terméket gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagokkal keverjük össze. Az ilyen célra alkalmas vivőanyagokra és felhasználásuk módjaira vonatkozólag utalunk például E. W. Martin: Remington’s Pharmaceutical Sciences 25 c. munkára. Az ilyen készítmények a találmány szerinti eljárással előállított interferon-fehérje hatásos mennyiségeit tartalmazhatják, alkalmas vivőanyagokkal elegyítve, oly módon, hogy a készítmények megfelelő módon adagolhatóak legyenek a gyógyászati 30 kezelést igénylő személyeknek. A. Parenterális beadásra szolgáló készítmények A humán immuninterferon parenterális úton adható be tumorellenes vagy vírusellenes gyógykezelést 35 igénylő vagy immunoszupresszív állapotokat mutató betegeknek. Az adagolás és a beadás módja hasonló lehet a klinikai vizsgálatokra jelenleg alkalmazott másfajta humán interferonokéhoz, így például naponta körülbelül lxK^-lOxlO6 egység, 1%-nál nagyobb 40 tisztasági fokú anyagok esetében pedig például 50x 106 egységig is emelkedhet a napi adag. A találmány szerinti eljárással előállított IFN-yadagjai a hatás fokozása céljából még számottevő mértékben tovább is növelhetők, minthogy ebből a termékbő lényegileg 45 hiányoznak az olyan egyéb humán fehérjék, amelyek embereknek beadva nem kívánatos mellékhatásokat okozhatnak. A lényegileg homogén IFN-y parenterális úton beadható adagjának példájaként 3 mg 2x10s egység/mg specifikus aktivitású IFN-y-t 25 ml 5 N humán szérum-albuminban oldhatunk (gyógyszerkönyvi minőségű szérum-albumint alkalmazva erre a célra), az oldatot egy bakteriológiai szűrőn átszűrjük, majd a leszűrt oldatot aszeptikus módon 100 ampullába osztjuk szét; ily módon egy-egy ampullában 6xl06 egység tiszta interferont kapunk parenterális beadásra alkalmas készítmény alakjában. Az így ampullázott készítményt, célszerűen hidegen, -20 °C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig. A készítmény biológiai értékmérése A. A vírusellenes aktivitás jellemzése. Antitest-semlegesítés céljaira a mintákat a szükséghez képest 500-1000 egység/ml koncentrációra hígítjuk foszfát-puffer sóoldat és marhaszérum-albumin (PBS-BSA) elegyével. Egyenlő térfogatú mintákat 2-12 óra hosszat inkubálunk 4 °C hőmérsékleten, nyúl antihumán-leukocita, fibroblaszt vagy immuninterferon antiszérum hígítás-sorozatával. Az ennek során alkalmazott anti-IFN-a és -ß a National Institute of Allergy and Infectious Diseases intézet terméke volt. Az anti-IFN-y-t 5-20%-os tisztaságú autentikus IFN-y-ből állítottuk elő; ez utóbbit stimulált perifériális vér-limfocitákból nyertük és tisztítottuk. A mintákat a vizsgálat előtt 3 percig centrifugáltuk 12 000 g-vel. A készítmény pH-2 értéken mutatott stabilitásának vizsgálata céljából a mintákat IN sósavoldattal p-2 értékre állítottuk be, majd 4 °C hőmérsékleten 2-12 óra hosszat inkubáltuk és a mérés előtt IN nátrium-hidroxid-oldattal semlegesítettük őket. A nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) szembeni érzékenység vizsgálata céljából a mintákat azonos térfogatú 0,2%os SDS-oldattal inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten 2-12 óra hosszat, majd ezután vetettük őket alá mérésnek. B. Az E. coli és COS-7 sejtek által termelt IFN-jellemzése Az IFN-a, IFN-ß és IFN-y standard minták különféle kezelések után mutatott jellemző viselkedésének adatait az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Vírusellenes aktivitás (egység/ml) Kezelés IFNct IFN-ß IFN-y E. coli W3110/ pIFN-y trp48 kivonat COS-7 sejt/ pSV y 69 szupernatáns Kezeletlen 375 125 250 250 62,5 pH-2 375 125 <6 <12 <4 0,1% SDS 375-<4 <8-nyúl anti-IFN-a <8 125 250 250 187 nyúl anti-IFN-ß 375 <8 187 250 125 nyúl anti-IFN-y 375 125 <4 <8 <4 14
