202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 Amint a fenti táblázat adataiból látható, az E. coli W3110/pIFN-y trp 48 és a COS-7/pSV y 69 által termelt interferon-aktivitás savérzékeny, SDS-érzékeny és az immuninterferon-antiszérum semlegesíti. Az IFN-a és IFN-ß antitestei nem semlegesítik. Ezek az adatok tehát megerősítik, hogy a fent leírt rendszer által termelt hatóanyagok immun interferonok, továbbá, hogy a p69 plazmid cDNS inszertum az IFN-y-t kódolja. A tennék tisztítása Az IFN-y szennyezésektől, például baktériumoktól való tisztításának egy lehetséges módját az alábbi általános eljárás-vázlat szemlélteti: 1. A sejtek extrakciója nagy vezetőképességű lízis-pufferoldatban (körülbelül 8 pH-értéken), egy homogenizátoron nagy nyomáson történő átvezetése, majd a távozó folyadék jégfürdőben történő lehűtése útján. 2. A DNS kicsapása a polietilén-iminnel keverés közben, például 4 °C hőmérsékleten, 3. A baktérium-fehérjék lecsapása a pH-érték módosítása útján, az IFN-y ezúttal is oldatban marad. 4. A szilárd részek elkülönítése 4 °C hőmérsékleten történő centrifugálással. 5. A szupematáns betöményítése (a pH-énék újbóli beállítása után) például ultraszűréssel. 6. A koncentrátum dialízise kis vezetőképességű pufferoldattal szemben. 7. A szilárd részek eltávolítása centrifugálással; az IFN-y ezúttal is oldatban marad. 8. Ioncserélő-kromatográfia karboximetil-cellulózon; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel. 9. Kromatografálás kalcium-foszfát-gélen; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel. 10. Ioncserélő kromatográfia karboxilmetil-cellulózon gyengén denaturáló körülmények között; eluálás növekvő ionerősségű grádienssel. 11. Elválasztás gélszűréses kromatográfíával. A fenti tisztítási eljárás alkalmazásával 95%-ot meghaladó tisztaságú terméket állíthatunk elő. A találmány szerinti eljárással előállított immuninterferon fehérjét meghatározott DNS-gén és deduktív aminosav-szekvencia meghatározás alapján definiáltuk (vö.: 5. ábra). A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az itt konkrétan leírt interferon esetében természetes alléi variációk létezhetnek és ilyenek egyénenkénti különbségekkel elő is fordulnak. Ezek a variációk az általános szekvencában mutatkozó aminosav-különbségekben, deléciókban, szubsztitúciókban, inszerciókban, inverziókban, egy vagy több aminosav hozzáadásában nyilvánulhatnak meg. Az összes ilyen alléi variációk is a jelen találmány körébe esnek. A találmány lényege ugyanis a rekombináns DNS- technológia alkalmazása különféle humán IFN-y-származékok előállítására; ezek különbözőképpen módosíthatók egy vagy több aminosav-szubsztitúció, deléció, addíció vagy más aminosavval való kicserélés útján. Mindezek a módosulatok a humán IFN-y oly változatai, amelyek a jellemző humán IFN-y aktivitást mutatják és így ezek előállítása egyaránt a jelen találmány tárgykörébe tartozik. A jelen leírásban konkrétan ismertetett DNS-t és aminosav-szekvenciát tartalmazó IFN-y (vö.: 5. ábra) előállítási eljárásának legelőnyösebb reprodukálási módja kétségtelenül a teljes gén szintetikus úton történő előállítása - erre vonatkozólag vö. például a (26) alatt idézett irodalmat -, de eljárhatunk oly módon is, hogy szintetikus dezoxi- oligonukleotidokat állítunk elő, amelyekkel a cDNS-forrás szondázható abból a célból, hogy a standard hidridizációs módszerekkel különítsük el a gént. Ha a kívánt IFN-y fehérjét kódoló nukleotidszekvencia már egyszer rendelkezésére áll, az IFN-y nagy tisztaságban történő előállításához szükséges expressziós, elkülönítési és tisztítási műveleteket a fenti leírásban ismertetett módon folytathatjuk le. Bár a jelen leírásban a találmány szerinti eljárás különlegesen előnyös kiviteli módjaira utaltunk, nyilvánvaló, hogy a találmány köre nem korlátozódik ezekre a különösen előnyös módozatokra; a találmány körét természetszerűleg az alábbi igénypontok határozzák meg. Idézett irodalom 1. Goeddel etc., Natura 287, 411 (1980). 2. Goeddel etc., Nature 290, 20 (1981). 3. Yelverton etc., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981). 4. Gutterman etc., Annals of Int. Med. 93, 399 (1980). 5. Goeddel etc., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980). 6. Yip etc., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78, 1601 (1981). 7. Taniguchi etc., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78, 3469 (1981). 8. Bloom, Nature 289, 593 (1980). 9. Sonnenfeld etc., Cellular Immunol. 40, 285 (1978). 10. Fleishman etc., Infection and Immunity 26, 248 (1979). 11. Blalock etc., Cellular Immunology 49, 390 (1980). 12. Rudin etc., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77, 5928 (1980). 13. Crane etc., J. Natl. Cancer Inst. 61, 871 (1978). 14. Stinchcomb etc., Nature 282, 39 (1979). 15. Kingsman etc.. Gene 7, 141 (1979). 16. Tschumper etc., Gene 10, 157 (1980). 17. Mortimer etc., Microbiological Reviews 44, 519 (198 ). 18. Miozzari etc., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978). 19. Jones, Genetics 85, 23 (1977). 20. Hitzeman etc., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980). 21. Hess etc., J. Adv. Enzyme Regül. 7, 149 (1968). 22. Holland etc., Biochemistry 17, 4900 (1978). 23. Bostian etc., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77, 4504 (1980). 24. The Molecular Biology of Yeast (1981. Aug. 11-18.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 25. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44, 613 (1975). 25a. Glzman, Cell 23, 175 (1981). 26. Goeddel etc., Nature 281, 544 (1979). 27. Itakura etc., Science 198, 1056 (1977). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
