202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 20 ml vízben újból szuszpendáltuk és 100 ng 312 bp EcoKl-Pvul DNS-sel (pPGK-300-ból) és 100 ng Eco- RI-FVwI DNS-sel (pB 1-ból) kapcsoltuk. A ligációs elegyet használtuk fel ezután az E. coli 294 törzs ampicillin-rezisztenciára való transzformálására. A kapott transzformánsok egyike pPGK-1500 volt. Ez a plazmid az 1500 bp PGK promoter-fragmenst tartalmazza, a DNS EcoRI-EcoRI vagy Hindlll-EcoRl darabjaként. 10 pg pPGK-1500-at Clal és EcoRI enzimmel teljesen lebontottunk, majd az enzimes lebontási reakcióelegyet 6%-os akrilamid-gélen elektrofotézisnek vetettük alá. A PGK promotert tartalmazó 900 bp fragmenét elektroelúció útján elkülönítettük. 10 pg pEFN-ytrp 48-at EcoRI és Hindi enzimmel teljesen lebontottunk és 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A közvetlen expresszióra alkalmas IFN-y cDNS-t tartalmazó 938 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük a gélről. Az élesztő expressziós vektort egy 3 faktort tartalmazó reakcióelegyben építettük fel, a PGK promoterfragmen (egy Clal-EcoRl darabon), a deléciós pFRM- 31 és a fent leírt módon elkülönített IFN-y cDNS ligációja útján. A ligációs reakcióelegyet 12 óra hosszat inkubáltuk 14 °C hőmérsékleten. Ezt a ligációs elegyet használtuk fel azután az E. coli 294-törzs ampicillinrezisztenciára való transzformálására. A transzformánsokat azután vizsgáltuk, hogy jelen van-e bennük a helyesen felépített pPGK-IFN-y expresszós plazmid (16. ábra). Az expressziós rendeszert tartalmazó plazmidokat használtuk fel az RH218 élesztő-törzs szferoplasztjainak triptofán-prototrofiára való transzformálására triptofánt nem tartalmazó agarban. Ezeket a rekombináns élesztősejteket azután rekombináns humán immuninterferon jelenlétére vizsgáltuk. Az élesztőkivonatokat a következő módon állítottuk elő: YNB+CAA tápközegben 10 ml-es kultúrákat tenyésztettünk Aő60—1-2 eléréséig, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és újból szuszpendáltuk 500 pl PBS pufferoldatban (20 mmól/1 NaH2P04, pH-7,4, 150 mmól/1 NaCl). A szuszpenzióhoz úgyanolyan össztérfogatban üveggyöngyöket(0,45-0,5 mm átmérőjű) adunk, majd az elegyet 2 percig kevertetjük. Az így készített kivonatot 30 percig centrifugáljuk percenként 14 000 fordulattal, majd a szupematáns folyadékot elkülönítjük és meghatározzuk benne az interferon-aktivitást, amely a citopátiás hatás gátlásán alapuló módszerrel mérve és IFN-a standarddal öszszehasonlítva 16 000 egység/ml volt. M. A pSV 69 vektor sejtkultúrájának felépítése Az SV40-eredetű 342 bázispárt tartalmazó Hindl- 11-PvuU fragmenst egy EcoRI restrikciós helyhez kötött fragmenssé alakítottuk át. A Hindlll helyet egy 5’-dAGCTGAATTC szintetikus oligomer hozzáadása útján konvertáltuk, míg a PvuII helyet egy EcoRI helybe történő tompavég-ligáció útján és ennek betöltésére polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmaztunk. Az így kapott EcoRI fragmenst a pML-1 EcoRI helyébe iktattuk be (28). Az amp1* géntől elfelé orientált SV40 késői promotert tartalmazó plazmidot azután tovább módosítottuk a pML-1 ampR génjéhez legközelebb eső EcoRI hely eltávolítása útján. (27). A klónozott HBV DNS 1023 bázispárt tartalmazó Hpal-Bgíll fragmentjét (60) elkülönítettük és a hepatitisz-B vírus (HBV) Hpal helyét egy 5’dGCGAATTCGC szintetikus oligomer alkalmazásával egy EcoRI hellyé alakítottuk át. Ezt az EcoRI-ög/II kötött fragmentet közvetlenül klónoztuk az SV40-eredetű plazmid fent leírt EcoRI-SomHI helyeibe. A fennmaradó EcoRI helyre azután az IFN-y gént iktattuk be a p69 egy 1250 bázipárt tartalmazó Pstl fragmentjén, a Pstl végeknek EcoRI végekké való átalakítása után. Olyan kiónokat különítetünk el, amelyekben az SV40 késői promoter megelőzte az IFN-y szerkezeti génjét. A kapott plazmidokat azután szövettenyészet sejtjeibe vezettük be (29) egy olyan módosított DEAE-dextrán módszer alkalmazásával, amelyben a DEAE-dextrán jelenlétében történő transzfekciót 8 óra hosszat folytattuk. A sejtközeget 2-3 naponként cseréltük. 200 mikroliter közeget vettünk el naponta biológiai interferon-meghatározás céljára. A transzfekció után 3 vagy 4 nappal a vizsgált mintákban általában 50-100 egység/ml interferont találtunk. Az elemzési adatok azt mutatják, hogy a kifejezett-termékből hiányzik a rekombináns humán immuninterferon N-terminális CYS-TYR-CYS része (vö.: 5. ábra), továbbá, hogy egy szignál-peptid hasítás van a CYS-GLN kapcsolatnál (az 5. ábra szerinti 3. és 4. aminosavnál); ezek szerint úgy látszik, hogy az érett polipeptid ténylegesen 143 aminosavból áll. N. A majomsejtekből kapott immuninterferon részleges tisztítása Annak érdekében, hogy a majomsejtekből származó humán IFN-y nagyobb mennyiségeit termelhessük, 10 darab 10 cm-es lemezen COS-7 sejtek friss egysejt-rétegeit fertőztük át összesen 30 (ig pDLEF3- mal 110 ml DEAE-dextrános közegben, amely 200 (ig/ml DEAE-dextránt (molekulatömeg: 500 000) és 0,05 mól/1 7,5 pH-értékű triszt tartalmazott DMEM- ben. 37 “C hőmérsékleten lefolytatott 16 órai inkubálás után a lemezeket DMEM-mel kétszer mostuk. 10% borjúembriószérumot (FBS) 2 mmól/1 glutamint. 50 Hg/ml G-penicillint és 50 mg/ml sztreptomicint tartalmazó 15 ml friss DMEM-et adtunk azután mindegyik lemezhez. A következő napon a közeget szérummentes DMEM-re cseréltük ki, majd minden nap szérummentes közeget adtunk a lemezekhez. A közegeket összegyűjtöttük és 4 °C hőmérsékleten tároltuk az elemzésig illetőleg a szabályozott pórusú üveghez (CPG) való kötésig. A transzfekció után 3 és 4 nappal kivett minták összegyűjtött frakcióit megelemezve azt találtuk, hogy lényegileg valamennyi minta tartalmazott aktivitást. 100 ml sejt-szupematánshoz 0,5 g aprószemcséjű szabályozott pórusú üveget (CPG 350, az Electronucleonics cég gyártmánya, szitafinomság 120/200) adtunk és az elegyet 4 °C hőmérsékleten 3 óra hosszat kevertettük, majd rövid ideig centrifugáltuk egy asztali centrifugában. A leülepedett üvegyöngyöket egy oszlopra vittük és alaposan mostuk egy 20 mmól/1 nátrium-foszfátot, 1 mól/1 nátrium-kloridot és 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmazó, pH-7,2 értékű puffer oldattal. Az aktivitást azután ugyanilyen, de 30% etilénglikolt is tartalmazó pufferoldattal eluáltuk, majd ugyanilyen, de 50% etilénglikolt tartalmazó pufferoldattal folytattuk az eluálást. Az aktivitás lényegileg teljesen a szabályozott pórusú üvegyöngyökhöz volt kötve; az eluálás során az eluált aktivitás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
