202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 használtuk fel azután egy primer-javítási reakcióban, amely úgy volt megtervezve, hogy első lépés legyen egy többlépéses eljárásban egy EcoRI restrikciós helynek a PGK szerkezeti gén szekvenciáját éppen megelőző PGK-5’-szegélyező DNS-be való bevitelére. 100 pg pBl plazmidot (20) teljesen lebontottunk Haelll enzimmel, majd 6%-os poliakrilamid-gélen futattuk. Az etidummal megfestett gél legfelső sávját (amely a PGK promoter- tartományt tartalmazza) a fentebb ismertetett módon, elektroleució útján elkülönítettük. Az így kapott terméket, amely a DNS 1200 bp Haelll darabja, Hincll-vcl emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen futtattuk. A 650 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük. 5 pg DNS-t kaptunk. A DNS mellett a 650 bp-os HaeUl-Hincll darabját 20 pl vízben újból szuszpendáltuk, majd a fent leírt foszforilezett primer-oldat 20 pl-jével elegyítettük. Ezt az elegyet fenol és kloroform elegyével egyszer extraháltuk, majd etanollal lecsaptuk a terméket. A szárított DNS-t 50 pl vízben újból szuszpendáltuk, majd egy forrásban levő vízfürdőben 7 percig melegítettük. Az oldatot azután szárazjég-etanol fürdőben hirtelen (10-20 másodperc alatt) lehűtöttük, majd jeges vízfürdőbe vittük át. Ehhez az oldathoz 50 pl olyan oldatot adtunk, amely 10 pl 10X DNS- polimeráz I puffert (Boehringer Mannheim), mindegyik dezoxinukleozid- trifoszfát 10 ml-jét (dATP, dTTP, dGTP és dCTP) 2,5 mmól/1 koncentrációban tartalmazó oldatot, 25 pl vizet és 5 egység DNS- polimeráz I Klenow-fragmenst tartalmazott. Ezt a 100 pl reakcióelgyet 4 óra hosszat inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután fenol-kloroform elegyével egyszer extraháltuk, a terméket etanollal kicsaptuk, liofileztük és 10 egység Sau3A-val teljesen emésztettük. A kapott oldatot 6%-os poliakrilamid-gélen futtattuk. A 39 bázispár méretnek megfelelő sávot levágtuk a gélről, majd elektroleució útján a fent leírt módon elkülönítettük a terméket. Ennek a 39 bp terméknek egy tompa vége és egy Sau3A tapadó vége van. Ezt a fragmenst egy módosított pFIF trp 69 vektorba (5) klónoztuk. 10 pg pFIF trp 69-et Xbal-gye\ linearizáltunk és fenol-kloroform elegyével egyszer extraháltuk, majd etanollal lecsaptuk. Az Xbal tapadóvég betöltésére DNS-polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmaztunk egy 50 pl térfogatú, mindegyik nukleozid-trifoszfátot 250 pmól koncentrációban tartalmazó reakcióé légyben. Ezt a DNS-t BamHl alkalmazásával levágtuk, majd 6%-os poliakrilamid gélen futattuk. A vektor- ffagmenst elektroelúció útján elválasztottuk a gélből, majd 20 pl vízben újra szuszpendáltuk. E vektor 20 ng-ját 20 ng fenti módon előállított 39 bp fragmenssel ligáltuk szobahőmérsékleten 4 óra hoszszat. A ligáviós reakcióelegy 1/5 részét használtuk fel az E. coli 294 törzs ampicillin- rezisztenciára való transzfomálására (LB+20 pg/ml amp lemezeken). A transzformánsokból kapott plazmidokat egy gyors szkrin-módszerrel (44) vizsgáltuk. Egy plazmidot a pPGK-39-t választottuk ki szekvencia-analízis céljára. E plazmid 20 pg-ját Xbal enzimmel kezeltük, etanollal kicsaptuk, majd 1000 egység bakteriális alkalíkus foszfázzal kezeltük 68 °C hőmérsékleten 45 percig. Ezt a DNS-t fenol-kloroform elegyével háromszor extraháltuk, maid etanollal lecsaptuk. A defoszforilezett végeket 32P-vel jeleztük egy 200 pCi [t32?] ATP-t és 10 egység T4poIinukleotid-kinázt tartalmazó 20 pl reakcióelegyben. A plazmidot Sű/I-gyel vágtuk és 6%-os poliakrilamid-gélen futtattuk. A 32P-jelzett inszertum-sávot elválasztottuk a géltől és kémiai lebontási módszerrel (52) szekvencia-vizsgálatnak vetettük alá. Ezen promoter-darab 3’-végén a DNS-szekvencia a várakozásnak megfelelő volt. 2. A 312 bp-os Pvul-EcoRl PGK promoter-fragment felépítése 25 pg pPGK-39 plazmidot (13. ábra) egyidejűleg kezeltünk 5-5 egység Sail és Xbal enzimmel, majd 6%-os gélen elektroforézisnek vetettük alá. A 39 bp-os promoter-darabot tartalmazó 390 bp sávot elektroelúció útján elkülönítettük. Az újra szuszpendált DNS-t 5aw3A-val emésztettük majd 8%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A 39 bp-os PGK promoter- sávot elektroeluálással elkülönítetük. Ez a DNS 39 bázispárt tartalmazott a PGK promoter 5’végéről egy SauiA-Xbál fragmensen. 25 pg pBl-et Pvul és Kpnl alkalmazásával emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A DNS 0,8 kbp sávját elektroelúció útján elkülönítettük, majd Sa«3A-val emésztettük és 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A PGK promoter 265 bp sávját (11. ábra) elektroelúcióval elkülönítettük. Ezt a DNS-t azután a fenti 39 bp promoter-fragmenssel ligáltuk szobahőmérsékleten 2 óra hosszat. A ligációs elegyet Xbal és Pvul alkalmazásával emésztettük, majd 6%-os akrilamid-gélen elektroforizáltuk. A 312 bp Xba-Pvul restrikciós fragmen eletroelúció útján elválasztottuk, majd hozzáadtuk egy 200 ng pBR322-t (41) (amelyet előzőleg különítettünk el és amelyből hiányzott a 162 bp Pvul-Pstl restrikciós fragment) és 200 ng Xbal-Pstl LelF A cDNS gént (amelyet előzőleg különítettünk el 20 pg pLelF trp A 25-ből) tartalmazó ligációs elegyhez. Ezt a három-faktoros ligációs elegyet használtuk fel az E. coli 294 törzs tetraciklin-rezisztenciára való transzformálására. A transzformáns kolóniákat miniszkrineltük (44) és az egyik kolóniát (pPGK-300) elkülönítettük, ez 304 bázispárt a PGK 5’-szegélyező DNS-ből, a LelF génhez kapcsolva egy pBR322-alapú vektorban. A LelF A gén 5’-végének a következő szekvenciája van: 5’-CTAGAATTC-3’. így a PGK promoter-fragmensből származó Xbal helynek e szekvenciába való fúz tója lehetőseget nyújt egy EcoRI helynek az Xbal helyhez való hozzáadására. A pPGK- 300 tehát tartalmazza a PGK-promoter egy részét egy Pvul-EcoRl fragmensben elkülönítve. 3. Egy 1500 bp EcoRI-EcoRI PGK promoter-fragmens felépítése 10 pg pBl-t Pvul és EcoRI enzimmel kezeltünk és egy 6%-os akrilamid-gélen futtattuk. A PGK 5’-szegélyező DNS-ből számazó 1.3 kb Pvul-EcoRI DNS- sávot elektroeluálással elkülönítettünk. 10 pg pPGK- 300-at EcoRI és Pvul enzimmel kezeltünk és a 312 bp promoter-ffagmenst az így kapott enzimes kezelési reakcióelegy 6%-os akrilamid-gélen történő elekroforézise után elektroelúcióval elkülönítettük. 5 pg pFRL4-et EcoRI-vel hasítottunk, etanollal kicsaptuk, majd bakteriális alkalikus foszfatázzal kezeltük 68 'C hőmérsékleten 45 percig. A kapott elegyet fenol kloroform elegyével háromszor extraháltuk, az így kapott DNS-t etanollal kicsaptuk, majd e vektor 200 ng-ját 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
