202284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új azoxiszármazékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202284 B 2 III. Fiziológiai jellemzők 1. A növekedés hőmérséklettartománya: 18-40 °C, előnyös növekedési hőmérséklettartomány: 26-38 °C 2. Zselatin elfolyósítás: negatív 3. Keményítő hidrolízis: pozitív 4. Sovány tej koagulálás: negatív Sovány tej peptonizálás: pozitív 5. Melanoid pigment képzés: negatív IV. Szénforrások hasznosítása A Pridham és Gottlieb agar tápot, L-arabinózt, D-xilózt, D-glükózt, D-fruktózt, inozitot, L-ramnózt és D-mannitot hasznosítja, a szacharózt és raffinózt nem hasznosítja. V Sejtfal A sejtfal hidrolízistermékei között L,L-2,6-diamino-pimelinsavat mutattunk ki. Az előzőekben ismertetett tulajdonságok alapján a KC-7367 törzset a Streptomyces nemzetségbe tartozónak tekintjük. Az általunk Streptomyces sp. KC-7367 jellel megjelölt törzset FERM BP-1277 számon letétbe helyeztük a Japán Fermentációs Kutató Intézetben (Fermentation Researc Isntitute, Agency of Industrial Science and Technology, Japán) 1987. 02. 04-én. A találmány szerint alkalmazhatók a Streptomyces sp. KC-7367 természetes és mesterséges mutánsai is. A Streptomyces sp. KC-7367 tenyésztésére az aktinomicéták tenyésztésére szokásosan alkalmazott módszerek használhatók. A tápközegben szénforrásként különféle anyagok használhatók, de előnyösek a keményítő, a glükóz, a glicerin, a maltóz, a dextrin, a szacharóz, fruktóz és a melasz, amelyeket egyenként vagy egymással kombinálva is alkalmazhatunk. A mikroorganizmus törzs által való asszimilálhatóságtól függően szénhidrogének, szerves savak és növényi olajok is alkalmazhatók. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szójabablisztet, élesztőkivonatot, száraz élesztőt, peptont, polipeptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, kazein-aminosavait, desztillációs maradékok oldaható anyagait, ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot, karbamidot vagy nátrium- nitrátot egyenként vagy egymással kombinálva. Szükség szerint adhatunk a tápközegbe szervetlen sókat, például nátrium-kloridot, kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, kalcium-kloridot, kalcium-karbonátot, kalciumhidroxidot, kobalt-kloridot, cink-szulfátot, vas-kloridot vagy vas-szulfátot, és igen kis mennyiségben fémeket. A szerves és szervetlen anyagok kívánt módon adagolhatók a mikroorganizmus szaporodásának és a KA-7367 termelésének az elősegítésére. Ha a tenyésztést levegőztetés mellett végezzük, habzásgátló anyagokat, például szilikonolajokat, paraffinokat vagy felületaktív szereket alkalmazhatunk. A tenyésztést végezhetjük szilárd táptalajon. Előnyösen azonban a tenyésztést folyékony tápközegben, előnyösen süllyesztett folyékony tenyészetben, az antibiotikum-termelésnél általában szokásos eljárással végezzük. A tenyésztést aerob körülmények mellett 20-35 °C, előnyösen 25-35 °C hőmérsékleten végezzük. A KA-7367 vegyületet rázott tenyészetben vagy fermentorban állítjuk elő. Mindkét esetben a mikroorganizmus 1-5 napos tenyésztése után aktív anyagok termelődnek és gyűlnek fel a fermentlében. Ha a fermentlében termelődött anyagok mennyisége eléri a maximumot, amit például Candida albicans alkalmazásával végzett biológiai vizsgálattal ellenőrizhetünk, a tenyésztést leállítjuk, és a KA-7367A és KA-7367B vegyületeket a fermentléből elkülönítjük és tisztítjuk. A KA-7367A és KA-7367B vegyületek a fermentléből szokásos módon izolálhatok, például a fermentlevet szűrősegédanyag alkalmazásával szűrjük, vagy centrifugáljuk, így a fermentlé szűrletét nyerjük, a kívánt anyagokat abszorbens alkalmazásával különítjük el, vagy a szűrletet oldószerrel extraháljuk. Az adszorbens alkalmazásával járó eljárásnál a tenyészet szűrletét adszorbensen, például aktív szénen vagy adszorbens gyantán, így Diaion HP-10, HP-20 vagy HP- 50 (a Mitsubishi Chemical Co., Ltd. terméke) vagy Amberlite XAD-2, XAD-4 vagy XAD-7 (a Rhom & Haas Co. terméke) gyantán engedjük át. Az adszorbenst ezután például etil-acetáttal acetonnal, metanollal vagy etanollal eluáljuk, és az eluátumot, az eluens kidesztillálásával besűrítjük. így az (IA) képletű KA-7367A és az (IB) képletű KA-7367B vegyületek elegyét kapjuk. Az oldószeres extrahálást szerves oldószerekkel, például kloroformmal, diklórmetánnal, etil-acetáttal, butil-acetáttal, n-butanollal vagy ezek elegyével végezzük, az oldószert vagy oldószerelegyet keverés közben öntjük a fermentlébe, a kapott elegyet a vizes és szerves fázis elkülönüléséig állni hagyjuk, majd a szerves fázisból az oldószert kidesztilláljuk, így az (IA) képletű KA-7367A és az (IB) képletű KA-7367B vegyületek elegyét nyerjük. A KA-7367A és KA-7367B vegyületek egymástól célszerűen például vékonyrétegkromatográfiás eljárással különíthetők el. Az elkülönített KA-7367A és KA-7367B vegyületek tovább tisztíthatók például gélszűréssel, például Sephadex LH-20-on (a Pharmacia cég terméke), vagy Toyopearl TSK HW-40-en (a Toyo Soda Co., Ltd. terméke); adszorpciós kromatográfiás eljárással szilikagélen vagy alumínium-oxidon; vagy nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással. Ezek az eljárások alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációk formájában. A következőkben a találmány szerint előállított KA-7367A és KA-7367B vegyületek fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságait mutatjuk be. 1. Megjelenés Neutrális színtelen olaj (mind az A, mind a B) 2. Molekulatömeg 198 (A), 200 (B) 3. Elemzési eredmények (A) C%-60,16, H%-9,12, N%-13,98; (B) C%-59,95, H%-10,3, N%-13,86. 4. Tömegspektrum (A) m/z 199 (MH+) (B) m/z 201,1607 (MH+) 6. Fajlagos forgatás Oq (A) -186“ (c-0,5, CH3OH) (B) +69* (c-1,2, CH3OH) 7. UV abszorpciós spektrum A metanolos oldatban mért UV abszorpciós spektrumokat az 1. és 5. ábrákon mutatjuk be. (A) 237 (35300) (B) 230 (45000) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
