202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 ecetsavanhidridet és etanol helyett etilénglikolt alkalmazunk. A feldolgozás után kapott terméket atmoszféranyomáson kolonnával frakcionáltan 182 *C- on desztillálva 2,0 g (2-hidroxi-etil)-acetátot kapunk. A frakcionált desztilláció során továbbá 191 °C hőmérsékleten desztilláló 2,2 g (2-acetoxi-etil)-acetátot kapunk. Az így kapott termék 20 °C-on mért sűrűsége, törésmutatója és forráspontja alapján azonos a Merck Index 8. kiadásában (1968) leírt termékkel. 22. példa: Lankacidin A előállítása összehasonlító mérésekkel 200 literes fermentorba 100 liter olyan táptalajt viszünk be, amely 10% dextrint, 0,5% Proflo-t (Traders Oil Mill Co., USA terméke) 2,0% zsírmentesített szójabablisztet, 1,0% kukoricáiét, 1,3% kukoricagluténlisztet, 0,025% p-amino-benzoesavat, 0,2% ammónium-szulfátot, 0,5% nátrium-kloridot, 0,1% vas(II)szulfátot, 0,005% réz(II)-szulfátot, 0,03% nikkel-szulfátot, 2,4% béta-ciklodextrint és 0,2% FS habzásgátló F-20 készítményt (Dow Coming Co., USA cég készítménye) tartalmaz, majd az elegyet 120 °C-on gőzzel sterilizáljuk. Ekkor a táptalajhoz 5 liter 1. referencia-példában leírt oltótenyészetet oltunk, és 25 °C hőmérsékleten 96 órán át inkubáljuk, miközben 1 VVM mennyiségű levegővel levegőztetjük, és 165 percenkénti fordulatszámmal keverjük. 60 liter így kapott tenyészethez 20 liter vizet és 2 kg Hyflosupercel-t (A Johns Manville Products Co., USA terméke) adunk, és az elegyet szűrjük. így 70 liter szűrletet kapunk. Az elegyben az 1. példában leírt HPLC-módszerrel meghatározzuk a lankacidin C tartalmat: ennek eredményeként az elegy a szűrlet 1 ml-ében 4100 pg lankacidin C-t tartalmaz. A szűrlet minden egyes liter térfogatát három 10 literes, üvegbélésű, keverővei felszerelt reaktorba visszük, a reaktorokat 1-től, 3-ig terjedő sorszámmal látjuk el. Az 1. reaktorban 100 mM ecetsavanhidridet tartalmazó 1 liter metil-izobutil-ketont mérünk; a 2. reaktorba 200 mM etil-acetátot tartalmazó 1 liter metil-izobutil-ketont mérünk; és a 3. reaktorba 200 mM ecetsavat tartalmazó metil-izobutil-ketont viszünk be. Az 1-3. reaktorokban lévő keverékeket 37 °C hőmérsékleten tartjuk keverés közben az acetilezési reakció lejátszatása céljából. Ezután minden egyes keverék szerves fázisából 1 ml-t kiveszünk, és az 1. példában leírt HPLC-módszerrel meghatározzuk a lankacidin A mennyiségét. A reakció • képződött lankacidin A mennyisége hozama - (--------------------------------------------------------) xl00 a lankacidin C kezdeti mennyisége A képlet alapján kapott hozamokat a 6. táblázat mutatja. Továbbá valamennyi reaktorból származó reakcióelegyből elkülöníjtük, és tisztítjuk a lankacidin A-t a 3. példában megadott eljárással. Az így kapott lankacidin A hozamát szintén a 6. táblázat mutatja. A 6. táblázatból világosan kitűnik, hogy a lankacidin A-t akkor kapjuk a legmagyobb hozammal, ha acetil-donorként ecetsavanhidridet alkalmazunk. 6. táblázat 1 2 3 A reakció hozama tömegszázalékban 95,6 10,1 (0,1% alatt) Hozam g-ban 3,28 0,33 0 1: Ecetsavanhidrid 100 mM koncentrációban 2: Etil-acetát 200 mM koncentrációban 3: Ecetsav 200 mM koncentrációban A reakció hozamát az alábbi képlettel számítjuk: Az 1 liter szűrletben képződött lankacidin A mennyisége--------------------------------------------------------------------------------xlOO Az 1 liter szűrletben mint kiinduló anyagban lévő 4,1 g lankacidin C A hozam: az elkülönített és tisztított lankacidin A mennyisége. 23. példa: 9-Propionil-maridomicin előállítása (Az la képletben Rí jelentése propionil csoport) Három kémcső közül (amelyek mindegyike 20 ml térfogatú, és csiszolt dugóval zárható) kettőbe egyenként 2 ml etil-propionátot töltünk, a harmadikba 2 ml metil-izobutil-ketont mérünk. Mindhárom kémcsőbe 10 mg (la) általános képletű maridomicint helyzünk [ahol a (la) képletben Rí jelentése hidrogénatom], majd a kémcsövek tartalmát alaposan összekeverjük, hogy oldatot kapjunk. A propionsav-etil-észtert tartalmazó két kémcsövet 1. reakciórendszemek, illetve 2. reakciórendszemek jelöljük. Mindárom reakciórendszerhez egyenként 2 ml trisz(hidroxi-metil)- amino-metán-maleinsav pufferoldatot (amely 0,2 M koncentrációjú, pH 7,0) adunk, amelyben előzőleg 2 mg/ml koncentrációban az 1. referenciapélda szerint előállított karboxil-észterázt oldottunk. A 2. és 3. reakciórendszerekhez egyenként 20 pl propionsavanhidridet adunk, és a lezárt kémcsöveket azonnal 30 percig rázzuk 28 °C hőmérsékleten. Ezután valamennyi reakciórendszer oldószeres fázisából egyenként 50 pl-t kiveszünk mikropipettával, és vákonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk (ehhez 0,25 mm vastagságú Kieselgel 60 lapot használunk, amelynek mérete 20x20 cm, a Merck and Co., USA cég gyártmánya). Az említett három mintán kívül, amelyek megfelelnek az 1., 2. és 3. reakciórendszemek, a (la) képletű maridomicin (ahol Rí jelentése hidrogénatom), valmint a 9-propionil-maridomicin (ahol Rí jelentése propionilcsoport) alkalmazásával szintén vékonyrétegkromatogrammot készítünk; futtatószemek aceton és toluol 1:1 arányú elegyét használjuk. Detektálásra jódgőzt alkalmazva a maridomicin Rf-értéke 0,46-nak, a 9-propionil-maridomicin Rf-értéke 0,57-nek adódik. Azokat a vékonyréteg-részeket, amelyek a mintákon a maridomicinnek, illetve 9-propionil-maridomicinnek megfelelnek, lekaparjuk a le5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
