202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 mezről, összegyűjtjük, és kis térfogatú etil-acetáttal extraháljuk. A kivonatokban kvantitatív módon meghatározzuk a szubsztrátumként alkalmazott maridomicint és a reakciótermékként kapott 9-propionil-maridomicint. E meghatározáshoz a következő irodalmi helyen adott módszert alkalmazzuk: „Colorimetric Quantitative Determination Method of Maridomycin Antibiotics” [Agricultural and Biological Chemistry, 43 847 (1979)]. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be. 7. táblázat Szubsztrátum Reakciótermék (Maridomicin) (9-PropioniI-maridomicin) 1. Reakciórendszer 9,3 mg 0,5 mg 2. Reakciórendszer nyomokban 9,9 mg 3. reakciórendszer nyomokban 9,8 mg Megjegyzés: Az 1. reakciórendszerben: 2 ml propionsav-etil-észter A 2. reakciórendszerben: 2 ml propionsav-etil-észter és 20 pl propionsavanhidrid A 3. reakciórendszerben: 2 ml metil-izobutil-keton és 20 pl propionsavanhidrid 24. példa: 9-Propionil-maridomicin előállítása 10 literes térfogatú, üvegbélésű, keverővei felszerelt reaktorba 2 liter előzőleg 28 °C-ra felmelegített olyan metil-izobutil- ketonos oldatot mérünk, amelyben előzőleg 10 g (la) általános képletű maridomicint, ahol az (la) általános képletben Rí jelentése hidrogénatom, oldottunk. Ehhez az oldathoz 2 liter 0,2 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-maleinsav pufferoldatban (pH 7,0) oldott, az 1. referencia-példa szerint előállított 500 mg karboxil-észterázt adunk, az oldószeres réteghez 200 ml propionsavanhidridet teszünk, majd egy órán át keverés közben játszatjuk le a reakciót. A reakcióelegyet 10 literes választótölcsérbe visszük át, és a vizes fázist elválasztjuk. A maradékhoz 500 ml 2 tömegszázalékos nátriumhidrogén-karbonát oldatot adunk, alaposan átkeverjiik, majd a vizes fázist elkülönítjük. A nátrium-hidrogénkarbonátos mosást megismételjük, és utána a szerves fázist a választótölcsérben kétszer kirázzuk 1 liter desztillált vízzel. Ezután a szerves fázist 3 literes kúpos lombikba helyezzük, 100 g vízmentes nátirum-szulfátot adunk hozzá, és a keveréket 2 órán át állni hagyjuk. A vízmentes nátriumszulfátot szűrőpapíron szűrjük, és a reakcióelegyet szárazra pároljuk, így kristályos nyers termékként 10 g (la) képletű (ahol Rí jelentése propionilcsoport) 9-propionil-maridomicint kapunk. E kristályos nyersterméket 1 liter toluolban oldjuk, és az oldatot 80 mm átmérőjű, 500 mm hosszúságú Merck-szilikagélből készült oszlopra öntjük, amelyet előzőleg toluollal egyensúlyoztunk. A 9-propionil-maridomicin az oszlopon adszorbeálódik. Ezután 3 liter toluolt bocsátunk át az oszlopon, és utána az eluálást előbb 2,5 liter 1:0,5 arányú toluol-aceton eleggyel, majd 1:1 arányú toluol-aceton eleggyel végezzük. Az eluátumot 5F-160 típusú Tokyo frakció-kollektorban, 20 ml térfogatú frakciókban fogjuk fel. A vegyület azonosítását vékonyréteg-kromatográfiával végezzük, a 23. példában leírt módszerrel, a 9-propionil-maridomicin kimutatása céljából. A célvegyületet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban bepároljuk. így 9,1 g fehér, kristályos terméket kapunk. Az elemanalízis szerint e kristályos termék 59,7% szenet, 8,0% hidrogént és 1,6% nitrogént tartalmaz, [a]D -61,3° (c-1 kloroformban). Ezek az elemzési értékek megegyeznek az Antimicrobial Agents and Chemotherapy 4, 142 (1973) irodalmi helyen leírt adatokkal. A termék színképe megegyezik a Chemotherapy 21, 908 (1973) irodalmi helyen leírt színképpel. A kristályos termék könnyen oldódik metanolban, etanolban és acetonban, viszonylag jól oldódik kloroformban, alig oldódik vízben. Ha 5 mg kristályos terméket 2 ml acetonban oldunk, és 2 ml sósavval rázogatjuk, akkor bíborvörös szín jelenik meg. Ha ezt az oldatot 2 ml kloroformmal kirázzuk, és utána állni hagyjuk, akkor a kloroformos fázis enyhe bíborvörös színt ölt. 20 mg fenti kristályos terméket 2 mg tioszemikarbaziddal 2 ml etanolban 1 órán át visszafolyós hűtő alatt forralva lehűtés után 0,2 ml reakcióelegyet kiveszünk, és ehhez 50 ml etanolt adunk. Az így kapott elegy abszorpciós színképét vizsgáőlva 270-273 nm hulláhossznál abszorpciós maximumot figyelhetünk meg. A kristályos termék fentebb leírt sajátságai és a vizsgáló próbák eredményei egyezésben vannak az „Explanation of Minimum Requirements of Antibiotics, Japan” (1986, Yakugyojihosha) 457. oldalán leírt termék (propionil-maridomicin) sajátságaival. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű karbonsavészterek - ahol a képletben Rl jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport; R2 jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú, adott esetben hidroxilcsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alkilcsoport, vagy lankacidin C-ből a 14- helyzetű- vagy maridomicinből a 9-helyzetű hidroxilcsoport elhagyásával képzett csoport - előállítására karboxil-észteráz katalizátor jelenlétében, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű hidroxilvegyületet - ahol R2 jelentése a tárgyi körben megadott - egy (III) általános képletű karbonsavanhidriddel - ahol Rt jelentése a tárgyi körben megadott - szerves oldószerben reagáltatunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (II) általános képletű vegyületként R2 helyében egyenes vagy elágazó szénláncú, adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesített 2-5 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó alkoholokat, lankacidin C-t vagy maridomicint alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy karboxil-észterázként kémiailag módosított, szerves oldószerben oldható karboxil-észteráz enzimet alkalmazunk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerben oldható karboxil-észterázként 2,4-bisz(0-metoxipolietilénglikol)-6-klór-s-triazinnal módosított karboxil- észteráz enzimet alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
