202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 át szárítjuk, és így 40 g porszerű fehérjeterméket kapunk. Eport 100 ml 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-aminometán-sósav pufferoldatban (pH 7,4) oldjuk, és az oldatot gélszűrésnek vetjük alá, amihez 1500 mm hosszúságú, 100 mm átmérőjű oszlopot alkalmazunk, amelyet Sephadex G-100-zal töltünk, és az eluálást azonos összetételű pufferoldattal végezzük mint fentebb, 10 ml/5 perc áramlási sebességgel. A karboxil-észteráz-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, és lineáris gradiens szerinti ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, amelyhez növekvő sókoncentrációt használunk. Az alkalmazott oszlop hosszúsága 400 mm, átmérője 50 mm, töltete DEAE Sephadex A-50. Az eluálást 2 liter 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán- sósav pufferoldattal végezzük (pH 7,4), amely 1 mólos koncentrációban tartalmaz nátrium-kloridot az 1. edényben; majd 2 liter 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-sósav pufferoldattal folytatjuk (pH 7,4) a 2. edényben. Az eluátum minden 10 ml térfogatát Toyo 5F-160K típusú frakció- kollektor segítségével frakcionáljuk, és így 300 ml karboxil- észteráz-aktivitást mutató frakciót gyűjtünk össze. Ehhez 200 g kristályos ammónium-szulfátot adunk 1 literes Erlenmeyer lombikba keverés közben, kisózás céljából. Az így kapott termékeket 5 °C hőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk a fehérjék teljes kicsapódása céljából, majd a csapadékot 5 °C hőmérsékleten 2000 x g sebességű centrifugálással öszegyűjtjük. Az így kapott csapadékot 50 ml 0,05 M trisz(hidroxi-metil)amino-metán-sósav pufferoldattal (pH 7,4) oldjuk, és az oldatot a fentebb leírt módon Sephadex G-100 alkalmazásával gélszűrésnek vetjük alá. A karboxil-észteráz-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, és lineáris gradiens szerinti ioncserélő kromatográfiának vetjük alá a fentiekben leírt módon, DEAE Sephadex A-50 alkalmazásával. így 250 ml karboxil-észteráz-aktivitással rendelkező frakciót gyűjtünk össze, amelyhez keverés közben 167 g ammónium-szulfátot adunk kisózás céljából. A keveréket 5 °C-on 24 óráig állni hagyjuk, majd a csapadékot a fentebb leírt módon centrifugálással elkülönítjük. A csapadékot 30 ml 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-sósav pufferoldatban (pH 7,4) oldjuk, és a fentiekben leírt módon, Sephadex G-100 alkalmazásával gélszűrésnek vetjük alá. Az így kapott karboxil-észteráz-aktivitással rendelkező frakciókat 100 mm hosszúságú, 10 mm átmérőjű oszlopon kromatografáljuk, amely 0,05 M trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-sósav pufferoldattal (pH 7,4) egyensúlyozott DEAE Sephadex A-50 töltetet tartalmaz. Az eluálást 100 ml fentiekben leírt pufferoldattal, majd 20 ml azonos, azonban 1 mól koncentrációban nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal végezzük. A karboxil-észteráz-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, cellofánból készült csőbe fecskendezzük dialízis céljából, és 2 liter víz alá helyezzük egy 3 literes Erlenmeyer lombikban. A dialízist 24 órán át folytatjuk, miközben a külső vizet mágneses keverővei keverjük. A dialízis befejezése után az oldatot 2 literes, padlizsánalakú lombikba visszük, és 2,7 kPa vákuumban 24 órán át liofilizáljuk (ehhez No. 10-146, MR-BA típusú eszközt alkalmazunk, a Virtis Co. Inc., USA gyártmánya), és így poralakú karboxil-észterázhoz jutunk [lásd; „Enzyme Nomenclature Section 3.1.1.1, Academic Press Inc. (1984)], amely Streptomyces rochei var. volubilis mikroorganizmusból származik, SDS gél- elektroforézissel és ultracentrifugás elemzéssel igazoltuk, hogy az így kapott karboxil-észteráz egyetlen fehérje. Az alábbiakban - egyes esetekben - az így kapott karboxilészterázt röviden karboxil-észteráz készítménynek nevezzük. 2. referencia-példa Kémiailag módosított enzim előállítása 8 ml 0,1 M nátrium-borát pufferoldatban (pH 9,5) 50 mg karboxil-észteráz készítményt oldunk, és 1,0 g 2,4-bisz(0-metoxi- polietilénglikol)-6-klór-s-triazint adunk hozzá (a polietilénglikol molekulatömege 6000), majd az elegyet 5 °C hőmérsékleten 1 órán át keverjük. Ekkor a reakció leállítása céljából a reakcióelegyhez 72 ml 0,2 M kálium-foszfát pufferoldatot (pH 7,0) adunk. Ezután a reakcióé legyet ultraszűrésnek vetjük alá (8050 típusú ultraszűrőn, az Amicon Division of Grace Corp. USA cég gyártmánya) YM-10 milliporszűrő alkalmazásával, majd 400 ml 0,2 M káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0) mossuk az elreagálatlan 2,4-bisz(0-metoxi-polietilénglikol)-6-klór-s-triazin eltávolítása céljából. Ezután a polietilénglikollal módosított enzimet tartalmazó oldatot 500 ml-es, padlizsánalakú lombikba helyezzük, és 2,7 kPa vákuumban 24 órán át liofilizáljuk. így 600 mg polietilénglikollal módosított karboxil-észterázt kapunk (ezt a továbbiakban röviden PEG-gel módosított észteráznak nevezzük). 1. példa: Lankacidin A előállítása 2 ml metil-izobutil-ketonos oldatot, amely 11 mM koncentrációban lankacidin C-t és 50 mM koncentrációban ecetsavanhidridet tartalmaz, 20 ml-es kémcsőbe helyezünk, és 0,3 ml PEG-gel módosított észterázt adunk hozzá 0,2 M trisz(hidroxi-metil)-aminometán-maleinsav pufferoldatban (pH 7,0). A PEG-gel módosított észteráz koncentrációja 12 mg/ml. Ezután rázókészüléken percenként 80 rázatással 37 °C hőmérsékleten rázatjuk. Ezután túlnyomásos folyadékkromatográfiával (ezt a következőkben röviden HPLC-módszemek nevezzük) az alábbiakban leírt módon megmérjük a képződött lankacidin A mennyiségét az 1. táblázatban feltüntetett időpontokban. A HPLC-módszer paraméterei a következők: Műszer: LC-5A típus (Shimazu Seisakusho Ltd., Japán gyártmánya) Oszlop: )t poracil oszlop (300x3,9 mm 0, a Waters Division of Millipore, USA gyártmánya) Hőmérséklet: 45 °C Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc A lankacidin C retenciós ideje 7,0 perc, a lankacidin A-é 3,5 perc. A lankacidin A mennyiségét kvantitatív módon határoztuk meg UV abszorpciós detektorral 254 nm hullámhosszon. Kontrollként 300 mM etil-acetát vagy 100 mM ecetsav alkalmazásával (50 mM ecetsavanhidrid helyett) megismételtük a fenti eljárást. Eredményeinket az 1. táblázatban mutatjuk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
