202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 1. táblázat A különböző időközökben képződött lankacidin A mennyisége (mM) Acetilcsoport-donor Reakcióidő perc Ecetsavanhidrid 50 mM Etil-acetát 300 mM Ecetsav 100 mM 0 —— 10 5,58 0,54 — 20 8,11 0,69-30 9,09 0,95 — 45 9,30 1,45-80 10,83 1,98 — 110 10,83 2,10-* a táblázatban 0,1 mM-t meg nem haladó értéket jelent Az 1. táblázatból világosan látható, hogy a lankacidin A képződési sebessége és mennyisége szempontjából az ecetsavanhidrid alkalmazása kedvezőbb, mint akár az etil-acetáté, akár az ecetsavé. Az ecetsav gyakorlatilag használhatatlan. 2. példa: Lankacidin A előállítása az acetilcsoport-donor mennyiségének változtatásával Az acetilcsoport-donor koncentrációját változtatjuk a 2. táblázatban bemutatott módon, 20 perc reakcióidő megtartásával, egyébként az 1. példában leírt eljárást követjük. A kapott eredmények a 2. táblázatban találhatók. 2. táblázat Különböző acetilcsoport-donorok alkalmazásával kapott lankacidin A mennyisége (mM) Acetilcsoport- A képződött lankacidin A-donor mennyisége mM mM Ecetsavanhidrid 1 0,55 2 1,06 3 1,40 5 2,51 7 3,44 10 4,76 15 6,93 20 7,28 Etil-acetát 500 0,85 1000 1,05 2000 1,76 3000 2,39 4000 3,28 5000 3,95 6000 4,33 7500 4,95 10000 6,13 * Ha acetilcsoport-donorként az etil-acetáttal azonos koncentrációban ecetsavat alkalmazunk, akkor lankacidin A képződése nem figyelhető meg. A(2)formulával megadott Linewaever-Burk-egyenlet alkalmazásával [Biochemical Dictionary, 1. kiadás, 1314 old. (1984), Tokyokagakudozin Ltd.], amely az ® formulájú Michaelis-Menten- egyenlet módosításából származik (idézett mű, 1239. old.) az acetilcsoport-donorként ecetsavanhidrid alkalmazásával végzett reakciót összehasonlítottuk a donorként etil-acetátot alkalmazó reakcióval. VmaxX[S]o v................................................... 1 [S]0+Km 1 Km 1 1 — = ------- x ----- + ------— ........... 2 v Vmax [S]o Vmax - ahol v: a reakciósebesség Vmax: a maximális reakciósebesség [S]o: a szubsztrátumok koncentrációja Km: a Michaelis-állandó Ha az acetilcsoport-donor 2. táblázatban feltüntetett koncentráció-értékeit az [S]0 helyére behelyettesítjük, és a képződött lankacidin A mennyiségeit, amely a 2. táblázatban látható, a v helyére helyettesítjük, akkor Km és Vmax értékei is a legkisebb négyzetek módszerével kiszámíthatók. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja. 3. táblázat Acetilcsoport-donor Km Vmax mM mM/20perc Ecetsavanhidrid 7,69 6,59 Etil-acetát 3010 5,40 A 3. táblázat világosan mutatja, hogy abban az esetben, ha ecetsavanhidridet alkalmazunk acetilcsoport-donorként, akkor a reakciótermék kielégítően előállítható kismennyiségű szubsztrátumokból, mivel a Km értéke sokkal kisebb, mint abban az esetben, ha acetilcsoport-donorként etil-acetátot használunk. 3. példa: Lankacidin A előállítása 10 literes, üvegbélésű, keverővei felszerelt reaktorba 2 liter metil-izobutil-ketont töltünk, és 37 °C-on tartva 10 g lankacidin C-t oldunk benne. Ehhez az elegyhez 300 ml 0,2 M trisz(hidroxi-metil)-aminometán-maleinsav pufferoldatban (pH 7,0) oldott 1,2 g PEG-gel módosított észterázt adunk. Összekeverés után az elegyhez 10 ml ecetsavanhidridet teszünk, majd 37 °C-on 40 percig keverjük. Ekkor a reakcióé légyhez 2 liter desztillált vizet teszünk keverés közben. Keverés után a reakcióelegyet 10 literes választótölcsérbe visszük, és a vizes réteget elkülönítjük. Az így kapott szerves oldathoz 500 ml 2%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adunk, alaposan keverjük, majd a vizes réteget ismét eltávolítjuk. Az így kapott elegyet azonos összetételű vizes nátrium-hidrogén- karbonát oldattal mossuk az ecetsav feleslegének eltávolítására. Ezután kétszer 5 liter desztillált vízzel mossuk választótölcsérben, és utána a szerves fázist elválasztjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
