202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 A fentiekben leírt karbonsavanhidridek vagy hidroxilvegyületek a találmány szerinti eljárás megvalósítása során szerves oldószerként is szerepelhetnek. A találmány szerinti reakciót előnyösen úgy hajthatjuk végre, hogy a karboxil-észterázt hozzáadjuk a karbonsavanhidridet és a hidroxilvegyületet tartalmazó szerves oldószeres keverékhez, és az így kapott keveréket alapos további keverésnek vetjük alá. Ha a reakcióban nagy mennyiségű víz van jelen, azaz ha szerves oldószerben oldhatatlan karboxil-észteráz enzimet alkalmazunk, akkor a reakciót előnyösen egyfázisú rendszerben, erélyes keverés közben végezhetjük mindaddig, amíg víz/olaj emulzió képződik. Ha a reakcióban kis mennyiségű víz van jelen, azaz ha szerves oldószerben oldható karboxil-észteráz enzimet alkalmazunk, akkor a reakciót erélyes keverés közben hajtjuk végre mindaddig, amíg homogén oldat képződik. A reakció hőmérsékletét és pH-értékét a tenyészetekből származó, különböző típusú enzimek, a szubsztrátumok és oldószerek szerint kell változtatnunk; általában kívánatos a reakciót körülbelül 5 'C és körülbelül 90 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen körülbelül 20-70 °C hőmérsékleten, körülbelül 2-10 pH-érték mellett, előnyösen körülbelül 3-9 pH-értéken lejátszatni. Az így kapott észtervegyületet a szokásos eljárásokkal - például szűréssel, desztillációval, betöményítéssel, csökkentett nyomáson való betöményítéssel, kromatográfiával - például szilikagélen vagy alumínium-oxidon végzett kromatográfiával - kristályosítással vagy átkristályosítással különíthetjük el és tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi nem-korlátozó jellegű példákban és referencia-példákban részletesen ismertetjük. Ezekben a példákban az összes százalék-értékek tömeg/térfogat-százalékot jelentenek, ha erre vonatkozóan más megjegyzést nem teszünk. 1. referencia-példa Enzim előállítása 500 ml táptalajt, amely 3,0% glükózt, 1,0% Proflo-t (Traders Oil Mill Co., USA cég gyártmánya), 3,5% kukoricalevet, 0,02% magnézium-szulfátot, 0,1% dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,05% szójababolajat és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, 20%-os vizes nátronlúgoldattal 7,0 pH-értékre állítunk. A táptalajt 2 literes Sakaguchi-lombikba helyezzük, és vattával ledugaszolva sterilizáljuk majd Streptomyces rochei var. volubilis (IFO 12507) (ATCC-21250) ferdeagaros tenyészettel oltjuk (lásd a 183695/1984 számú japán közrebocsátási iratot), majd rázógépen (83 rázás percenként) 28 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. A fentiekkel azonos összetételű 30 liter táptalajt 50 literes fermentorba helyezünk, és sterilizálunk. 500 ml fentiekben leírt táptalajt oltunk a fenti tenyésztőközegbe, és 24 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk, miközben 1 VVM sebességgel levegőztetjük (a „VVM” jelenti a közeg térfogatán percenként áthaladó levegő térfogatát), és percenként 150 fordulat sebességgel keverjük. Ezt alkalmazzuk oltótenyészetként. 200 literes fermentorba 100 ml táptalajt helyezünk, amely 10% glicerint, 2,0% Proflo-t (Traders Oil-Mill. Co. USA), 0,5% kukoricalevet, 1,0% Poliepton-t (Daigo Nutritive Chemicals Ltd., Japán), 0,1% vas(II)-szulfátot, 0,01% szójababolajat és 2,0% béta-ciklodextrint tartalmaz, majd hozzáadunk annyi 20%-os vizes nátronlúgoldatot, hogy a táptalaj pH-értéke 7,0 legyen, és utána gőzzel 120 'C-on 20 percig sterilizáljuk. Ehhez a táptalajhoz 5 liter fentiekben leírt oltótenyészetet adunk, és az elegyet 24 °C hőmérsékleten 96 órán át inkubáljuk, miközben 1 VVM sebességgel levegőztetjük, és percenként 165 fordulatszámmal keverjük. 60 liter így kapott táptalajhoz 20 liter vizet és 2 kg Hyflo-Supercel-t (Johns Manville Products Co. készítménye, USA) adunk, és az elegyet szűrjük, így 70 liter szűrletet kapunk. 60 literes edénybe 10 liter szűrletet helyezünk, 40 liter etanolt adunk hozzá, és alaposan átkeverjük egy keverőbottal. Ezután az elegyet 5 °C hőmérsékleten 12 órán át állni hagyjuk a fehérjék kicsapása céljából. A felülúszó folyadékot szifon segítségével eltávolítjuk, és így zavaros-fehér csapadékot kapunk. A csapadékot 2000 x g sebességgel centrifugáljuk, miközben a hőmérsékletet 5 °C-on tartjuk, s így a csapadék víztartalmát a lehető legkisebb értékre csökkentjük. Az így kapott terméket etanollal mossuk, majd ugyanolyan módon centrifugáljuk, mint fentebb leírtuk. A csapadékokat öszegyűjtjük, és 6,6 kPa vákuumban 10 °C hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk, így 200 g porszerű terméket kapunk. 500 ml 0,05 M trisz(hidroxi-metil)- amino-metán-sósav pufferoldatban (pH 7,4) 2000 x g sebességgel végzett centrifugálással 5 “C hőmérsékleten kapjuk a fehérjéket tartalmazó oldatot. Az így kapott oldathoz 2 liter etanolt adunk, és alaposan átkeverjük, hogy a fehérjék ismét kicsapódjanak, majd a keveréket 5 °C-on 24 óráig állni hagyjuk, és a felülúszó folyadékot szifonnal eltávolítjuk. A csapadékot 5 °C-on 2000 x g sebességgel centrifugáljuk a felülúszó folyadék teljes eltávolítása végett, utána etanollal mossuk, és a fentiekben leírt módon centrifugáljuk a csapadék összegyűjtése céljából. A csapadékot 6,6 kPa vákuumban 10 °C hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk, és így körülbelül 100 g porszerű fehérjeterméket kapunk. A port 300 ml 0,05 M trisz(hidroxi-metil)-aminometán-sósav pufferoldatban (ph 7,4) oldjuk, és az oldhatatlan részt 50 °C hőmérsékleten 2000 x g sebességgel végzett centrifugálással eltávolítjuk. Az így kapott oldatot gélszűrésnek vetjük alá, amihez 1500 mm hosszúságú, 200 mm átmérőjű oszlopot alkalmazunk, amely 0,05 M trisz(hidroximetil)-amino-metán-sósav pufferoldattal (pH 7,4) egyensúlyozott Sephadex G-50-t tartalmaz. Az oszlopot ugyanezzel a pufferoldattal, 20 ml/5 perc áramlási sebességgel eluáljuk. A karboxil-észteráz p-nitro-fenil-ecetsav alkalmazásával megállapított aktivitásának az alapján [lásd: Journal of Biological Chemistry 170, 467 (1947)] 400 ml térfogatú, karboxil- észteráz-aktivitást mutató frakciókat gyűjtjünk, amelyekhez 2,4 liter etanolt adunk, majd az így kapott elegyet mechanikusan keverjük egy 3 literes Erlenmeyer lombikban a fehérjék kicsapása végett. Ezután az elegyet 5 'C-on 24 órán át állni hagyjuk, a csapadékot 5 °C-on 2000 x g sebességgel végzett centrifugálással összegyűjtjük, 6,6 kPa vákuumban 10 °C hőmérsékleten 24 órán 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
