202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 A találmány szerinti eljárásban karboxil-észterázként például alkalmazható: állati májból származó észteráz, így a sertésmáj- észteráz [forgalomba hozza a Sigma Co. USA; ez az észteráz előállítható a következő irodalmi hely szerint: Methods in Enzymology, 1, 657 (1955)] valamint T-2636 észteráz [lásd például: The Journal of Antibiotics 24, 1 (1971)], amely Streptomyces rochei var. volubilis mikroorganizmusból származik. A karboxil-észterázt természetes (natív) vagy tisztított formában alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárásban bármilyen mértékben tisztított karboxil-észteráz felhasználható: alkalmazhatunk például olyan nyers enzimrendszereket, amelyeket fehérjék táptalajból való extrakciójával állítunk elő, vagy használhatunk tisztított, egyetlen fehérjét tartalmazó készítményeket is. Ezenfelül a reakció sima előrehaladásának a biztosítása céljából szerves oldószerben oldható, kémiailag módosított karboxil-észterázt is felhasználhatunk a találmány szerinti eljárás megvalósítása során. A karboxil-észteráz enzim kémiai módosításának vonatkozásában megemlítjük például a 2,4-bisz(0- metoxi-polietilénglikol)-6-klór-s-triazint (ezt a továbbiakban röviden aktivált PEG2-vel jelöljük), amely enzimfehérjékkel érintkezésbe hozva módosított fehérjékhez vezet, amelyek a polietilénglikolhoz kapcsolódnak [lásd: Biochemical and Biophysical Research Communications, 122, 845 (1984)]. A találmány szerinti eljárásban mind szerves oldószerben oldható, mind szerves oldószerben oldhatatlan karboxil-észterázt alkalmazhatunk. Előnyös azonban a szerves oldószerben oldható karboxil-észteráz használata. A karboxil-észterázt általában vizes oldószerrel készült oldatában alkalmazhatjuk. (Vizes oldószerként például valamilyen pufferoldat, így trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt és maleinsavat tartalmazó pufferoldat használható). A szerves oldószerben oldható karboxil-észterázt valamilyen szerves oldószerrel készült, kismennyiségű vizet tartalmazó oldata alakjában alkalmazhatjuk. A karboxil-észterázt továbbá karboxil-észteráz enzimet termelő mikroorganizmus kultúraszűrletének az alakjában is alkalmazhatjuk. Továbbá, a karboxil-észterázt immobilizált enzim alakjában is használhatjuk. Ebben az esetben kívánatos a reakciót olyan körülmények között végezni, hogy vizes fázis csaknem egyáltalán ne alakuljon ki. A reakciót végezhetjük például úgy, hogy a szerves oldószerben oldható karboxil-észterázt oszlopon immobilizált enzim formájában alkalmazzuk, és az eluálást a hidroxilvegyületet és a karbonsavanhidridet tartalmazó szerves oldószerrel végezzük. A találmány szerinti eljárásban (III) általános képletű karbonsavanhidrideket alkalmazhatunk, előnyösen ecetsavanhidridet, propionsavanhidridet, n-vajsavanhidridet, izovajsavanhidridet, n-pentánsavanhidridet, n-kapronsas’anhidridet és benzoesavanhidridet. A (III) általános képletű vegyÖletekben Rí jelentése metil-, etil-, n-propil-, izopropil-, n-butil-, terc.-butil-, n-pentil-, n-hexil-, vagy fenilcsoport. A találmány szerinti eljárásban (II) általános képletű hidroxilvegyületként például a következő hidroxilvegyületek használhatók: alkoholok, például egyértékű alkoholok, így a metanol, etanol, n-propanol, izopropanol és n-butanol; kétértékű alkoholok, így az etilénglikol, 1,4-butándiol; vagy többértékű alkoholok, például a glicerin; valmint lankacidin C. Előnyösen 2-4 szénatomos alkoholokat, lankacidin C-t vagy maridomicint alkalmazunk hidroxilvegyületként. A (II) általános képletű vegyületben R2 jelentése előnyösen: metil-, etil-, n-propil-, izopropil, n-butil-, terc-butil- vagy n-pentilcsoport. A fentiekben említett alkilcsoportok szubsztituálva lehetnek például: hidroxilcsoporttal, mint pl. 2-hidroxi-etil-csoport. Ha hidroxilvegyületként lankacidin C-t alkalmazunk, akkor célszerű a lankacidin C szerves oldószerrel készült oldatát, valamint valamilyen kultúratáptalaj szűrletét alkalmazni, amint ezt alább az 5. példában leírjuk. A karbonsavanhidridet körülbelül 1-100 mólegyenérték, előnyösen 2-20 mólegyenérték mennyiségben alkalmazzuk a hidroxilvegyületre számítva. A találmány szerinti eljárásban szerves oldószerként olyan oldószert alkalmazhatunk, amelynek pH- értéke körülbelül 3-10, és amely az adott reakciókörülmények között a karboxil-észteráz aktivitását nem csökkenti. A találmány szerinti eljárásban szerves oldószerként alkalmazhatók például: nyílt szénláncú szénhidrögének, így n-hexán, n-heptán, n-pentán, izohexán, « diklór-metán, kloroform, szén-tetraklorid, etilén-diklórid, etilidén-diklorid, vinilidén- diklorid, butil-klorid, amil-klorid, allil-klorid, etil-bromid-dibróm-etán, klóretil-bromid és fluor-triklór-metán; gyűrűs szénhidro- .jegének, például ciklohexán, metil-ciklohexán, dekalin, <5 benzol, toluol, xilol, etil-benzol, 1,2,3,4-tetrahidronaftalin (tetralin), klór-benzol, o-diklór-benzol, brómbenzol, o-klór- toluol és alfa-klór-naftalin; éterek, így - a dietil-éter, di(klór-etil)-éter vagy etilénglikol-mono- -v metil-éter; acetálok, például a metilál vagy az ace- . taldehid-dietil-acetál; heterociklusos vegyületek, például a furán, furfurol, 2-metil-furán, tetrahidropirán, 1,2-propilén-oxid, epiklórhidrin-l,4-dioxán, piridin, morfolin; ketonok, például metil-etil-keton, metil-npropil-keton, metil-n-butil-keton, metil-izobutil-keton, metil-n-amil-keton, dietil-ketno, etil-n-butil-keton, diaceton-alkohol, mezitil-oxid, ciklohexanon, metil-ciklohexanon, acetofenon és acetonil-aceton; észterek, így a metil-formiát, etil-formiát, metil-acetát, etil-acetát, metil-propionát, metil-butirát, etil-aceto-acetát, metil-benzoát, metil-szalicilát, etil-abietát, dietil-oxalát, dietil-malonát, dietil-ftalát, és dioktil-adipát; foszfátok, például a trietil-foszfát; karbonátok, ígf a dietil-karbonát; aminok például a trimetil-aminpsavamidok, így a formamid, N,N-dimetil-foimamid; nitrilek, például az acetonitril; kéntartalmú vegyületek, például a szén-diszulfid és a dimetil-szulfoxid; valamint a petróleum desztillációjából származó termékek, például a petroléter, benzin, és Ugróin. Előnyösen olyan szerves oldószert alkalmazunk, amely vízzel két fázist alkot. Ezek közül előnyösen a ketonokat és észtereket alkalmazzuk. Különösen előnyös a metil-etil-keton, metil-n-propil-keton, metil-n-butil-keton, metil-izobutil-keton, metil-acetát és az etil-acetát használata. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
