202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 A B5’ és BIO’ oligo- nukleotidok Hpall és terminális BamHI és EcoRI restrickciós helyeket tartalmaznak. A terminális felismerhető helyek különösen alkalmasak klónozás céljára. A H1-H8 jelű, 8 oligo-nukleotidot előzőleg a humán inzulin B- láncát meghatározó gén előállítására használták [Goeddel és munkatársai (1979)], ez tartalmazza a B-lánc génjének azt a részét, amely az 1-13. aminosavat határozza meg, tartalmazza továbbá az N-terminális metionin kódonját. A B-lánc génjének jobb felét a Bi, B2, B3, B4, Bs\ Bő, B7, Bs, B9 és Bio’ sorszámú oligo-nukleotidokból állítjuk elő T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal végzett ligálással Goeddel és munkatársai szerint (1979) eljárva. A kapott ffagmens kódolja a humán inzulin B-láncának 14-30. aminosavát, és az összekötő lánc első argininjét. A génszekvenciában hasonló leolvasási fázisban egy Hpall restrikciós hely van beépítve, ugyanúgy helyezkedik el, mint a humán inzulin génbe levő Hpall hely. A ligáit génfragmens poliakril-amidos gél-elektroforézises tisztítása után elektroelúciót végzünk, és az izolált legnagyobb ffagmenst pBR322 plazmidba építjük be HindlII-BamHI hasítást követően. A kapott pBR3 jelű plazmidot E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. A plazmid ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát határoz meg, és tartalmazza a kívánt nukleotid szekvenciát. Ezután két fragmenst ligálunk; a pBR3 plazmid 58 bázispárból álló HindlII-BamHI fragmensét, és a pBHl plazmid 46 bázispárból álló EcoRI-HindlII fragmensét [lásd Goeddel és munkatársai (1979)]. így olyan fragmenst kapunk, amely EcoRI és BamHI végekkel rendelkezik. Ezt a fragmenst EcoRI és BamHI enzimekkel hasított pBR322 plazmidba építjük be, ismert módon, és a kapott pIB3 jelű plazmidot E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. Sokszorosítást és izolálást követően a pIB3 plazmidot EcoRI és Hpall restrikciós endonukleázokkal kezeljük, egy olyan szintetikus génfragmens előállítására (lásd a 15. ábra, 1 fragmensét), amely meghatározza a proinzulin N-terminális aminosavait és a metionint. A szintetikus gént poliakril-amid gél-eletroforézissel ismert módon izoláljuk. I. A humán proinzulin 50 C-terminális aminosavait meghatározó cDNS izolálása A mellékelt 16. ábrán adjuk meg a cDNS előállításának sémáját. Az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát állítjuk elő: pCCGGATCCGGTTTisT. Ez a szekvencia tartalmaz egy BamHI enzim által felismert helyet, és egy körülbelül 20 tagból álló 3’politimidilsav részt. A szekvenciát felhasználjuk a reverz transzkriptáz által vezérelt cDNS szintézishez. A prímért terminális dezoxi-ribonukelinsav-traszferázzal állítjuk elő [Enzo Biochem., 200 egység] 0,6 ml reakcióelegyben 1 pmól BamHI dekanukleotid jelenlétében, l,5xl0'4 (imól TTP-vel. A reakciót 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, Chang és munkatársai által leírt pufferben [Nature, 275, 617 (1978)]. A humán inzulinóma szövetet az alábbi helyen szereztük be: Institute für Diabetesforschung, München, Nyugat-Németország. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a humán inzulinóma szövet hozzáférhető, és több más forrásból is beszerezhető. A humán inzulinóma szövetből a poli A hírvivő ribonukleinsav (2,5 pg) izolálható Ullrich és munkatársai szerint [Science, 196, 1313 (1977)]. Ez kétszálú cDNS molekulává alakítható át Wickens és munkatársai szerint [J. Bioi. Chem., 253, 2483 (1978)]. Úgy járunk el, hogy az alábbi összetételű, 80 pl térfogatú reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten előinkubáljuk: 15 mmól trisz-hidro-klorid (pH=8,3, 42 “C hőmérsékleten), 21 mmól kálium-klorid, 8 mmól magnézium-diklorid, 30 mmól ß-merkapto-etanol, 2 mmól dCCGGATCCGGTTisT primer és 1 mmól dNTP. Ezután reverz transzkriptázt adagolunk, és az elegyet 15 percen át 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott ribonukleinsav- dezoxi-ribonukleinsav hibridet ismert módon denaturáljuk. A komplementer cDNS szálat 150 pl alábi összetételű reakcióelegyben szintetizáljuk: 25 mmól trisz-hidro-klorid, pH-8,3, 35 mmól kálium-klorid, 4 mmól magnézium-diklorid, 15 mmól ß-merkapto-etanol, 1 mmól dNTP és 9 egység Klenow polimeráz I. Az elegyet 90 percen át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az inkubálást 4 °C hőmérsékleten 15 órán át folytatjuk. Ezután 2 órán át 1000 egység SÍ nukleáz jelenlétében [Miles Laboratories, Elkhart, Indiana] 37 °C hőmérsékleten emésztjük Wickens és munkatársai szerint (1978) eljárva. A kapott 0,37 pg mennyiségű, kétszálú cDNS terméket 8% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk, és az 500 bázispámál nagyobb fragmenseket eluáljuk. A ffagmens 3’-végeihez terminális dezoxi-nukleotidil transzferázzal oligo-dezoxi-citidilsav végeket kapcsolunk Maizei szerint eljárva [Meth. Virol., 5, 180 (1971)]. A dC végű cDNS fragmenseket ezután pBR322 plazmidba építjük be, amit előzőleg Pstlrestrikciós enzimmel kezeltünk, és azután terminális dezoxi-nukleotidil transzferázzal dezoxi-guanidilsav véggel láttunk el. A kapott plazmidokkal E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, és a kapott izolátumokat LB és TÉT táptalajon szélesztjük. A tetraciklinre rezisztens, de ampicillin antibiotikumra érzékeny telepeket izoláljuk, és bizonyítjuk a három PstI restrikciós hellyel rendelkező plazmidok jelenlétét. Ez a restrikciós kép jelzi a proinzulin gén jelenlétét [Sures és munkatársai, Science, 208, 57 (1980)]. Egy plazmidot pHI104 jellel jelöltünk, ez egy 600 bázispárból álló beépített szakaszt tartalmaz, és adja a várt PstI restrikciós képet. Tartalmazza továbbá a cDNS preparálása során bevezetett 3’-poliA és poliGC szakasz között a BamHI helyet. A 14. ábrán mutatjuk be a beépített szakasz bizonyos nukleotid szekvenciáját. J. A humán proinzulint kódoló gén összeállítása A humá proinzulint kódoló gén összeállításának sémáját a mellékelt 15. ábrán mutatjuk be. A 15. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
