202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 ábrán 1 számmal jelzett fragmens egy szintetikus génszegmens, amely a proinzulin első 31 aminosavát kódolja. Ezt 50 pg pIB3 plazmidból állítjuk elő, a fentiek szerint EcoRI és Hpall restrikciós endonukleázokkal hasítva. Ez a fragmens tartalmaz továbbá egy metionint kódoló ATG kódont a preproinzulin preszekvenciája helyett. A 32-86. aminosavakat és a mRNS molekula 3’-nem transzlatált régióját, illetve a transzlációs stop jelet tartalmazó cDNS génszegmenst 40 pg pHH04 plazmidból állítjuk elő BamHI és azt követő Hpall restrikciós enzimmel való hasítással. A két fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és az azt követő elektroelúcióval izoláljuk. A két génfragmenst ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal 20 pl ligáz pufferten összekapcsoljuk. A reakciót 4 °C hőmérsékleten végezzük 24 órán át. 50 pl vízzel hígítjuk az elegyet, és fenollal, majd kloroformmal ismert módon extraháljuk és azután etanollal kicsapjuk a terméket. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel kezeljük, ezen felismerő helyek regenerálására és a génpolimerek eltávolítására. Az összeállt proinzulin gént poliakril-amid gélen kivitelezett elektroforézissel tisztítjuk, és pBR322 plazmidba építjük, EcoRI és BamHI emésztést és T4 dezoxiribonukleinsav ligázzal kivitelezett ligálással. A kapott dezoxi- ribonuklainsavat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk, és a kapott telepeket tetraciklin érzékenységre és ampivillin rezisztenciára vizsgáljuk. Az egyik telepből izolált pHI3 plazmid tartalmazza a kívánt proinzulin gént, amit nukleotidszekvencia analízissel jellemzünk. K. A humán proinzulint tartalmazó kimeraprotein kifejezésére alkalmas plazmid előállítása A teljes humán proinzulin gént, amely tartalmazza a metionint kódoló N-terminális kódont is, a pHI3 plazmidból izoláljuk EcoRI és BamHI restrikciós enzimes kezeléssel. A fragmenst gél- elektroforézissel tisztítjuk, és ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligáljuk az 5. példa G. pontja szerint előállított pSOM7A 2A plazmidból származó Pstl-EcoRI részleges emésztéssel kapott fragmenshez, és az 5. példa F. pontja szerint kapott pHKYlO plazmid nagyobb Pstl-BglII fragmenséhez. 1 pg EcoRI és BamHI végekkel rendelkező komplett humán proinzulin gént, 4 pg pSOM7A2A4 Pstl- EcoRI (részleges) fragmenst és 1 pg pHKYlO Pstl- BglII fragmenst ligálunk T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal, ligáláshoz használt pufferben, 4 °C hőmérsékleten 24 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. Ampicillin és tetraciklin antibiotikumok jelenlétében növekvő telepeket szelektálunk, és ezekben megtaláljuk a pHI7A4Al plazmidot, amely olyan proteint fejez ki, amelynek molekulatömege azonos a várt trp LE’-proinzulin fúziós peptid várt molekulatömegének. A fenti proteint kifejező pHI7A4Al plazmidot teljes mértékben jellemzünk, mind a dezoxi-ribonukleinsav szekvencia megállapításával, mind pedig a beépült gén és a vektor dezoxi- ribonukleinsav restrikciós helyeinek vizsgálatával. A pHI7A4Al plazmidot a mellékelt 15. ábrán mutatjuk be. A plazmid könnyen szelektálható, mivel az ampicillin és tetraciklin antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gén a klónozás során helyreállt. 6. példa A pNM608 plazmid és az E. coli KI 2 RV308/pNM608 törzs előállítása A. pHübAtsl plazmid 253 bázispárból álló Eco- Rl-Hpal fragmensének előállítása 5 pg pHI7A4Al plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, 10 pl (10X) alábbi összetételű reakciópuffert, 80 pl vizet és 5 pl (5 egység) Hpal restrikciós enzimet keverünk: 100 mmól trisz-hidro-klorid, pH-7,0, 100 mmól magnézium-diklorid, 60 mmól ß-merkapto-etanol, 200 mmól kálium-klorid. A reakciót 1 órán át 37 'C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítása 5 percen át 70 °C hőmérsékleten való inkubálással történt. Ezután jégfürdőben lehűtjük az elegyet, 12 pl 1 mólos pH=7,2-jű trisz-hidro-klorid-oldatot, 7 pl vizet és 1 pl (10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá. A kapott elegyet először 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd ezután 5 percen át 70 °C-on inkubáljuk. Jégfürdőben lehűtjük az elegyet, és a kapott dezoxi- ribonukleinsavat fenollal és kloroformúzoamil-alkohol (24:1) arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Az előállítandó 253 bázispárból álló EcoRI-Hpal restrikciós fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elektroelúcióval különítjük el, etanollal kicsapjuk, és a kicsapódott terméket 10 pl TE-pufferban oldjuk, az oldathoz pedig felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk. B. A pHI7MAl plazmid 34 bázispárból álló Hpal- Taql fragmensének előállítása 32 pl (5X) alábbi összetételű EcoRI pufferban 20 pg pHI7A4Al plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, 124 pl vizet és 4 pl (20 egység) EcoRI restrikciós enzimet inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 1 órán át: 250 mmól nátrium-klorid, 500 mmól trisz-hidro-klorid, pH=7,2, 25 mmól magnézium-diklorid, 30 mmól ß-merkapto-etanol. A reakció leállítására 5 percen át 70 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A kapott 862 bázispárból álló EcoRI fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen végzett elektroforézissel és az azt követő elektroelúcióval izoláljuk. A terméket etanollal csapjuk ki. A fragmenst ezután 100 pl, 16 egység Hpal restrikciós enzimet tartalmazó Hpal pufferban oldjuk. 37 °C hőmérsékleten inkubálunk 1,5 órán át, majd 7,5 egység Taql restrikciós enzimet adagolunk. Az inkubációt további 1,5 órán át folytatjuk, majd a fragmenseket ismert módon különítjük el 7,5% poliakril-amidot tartalmazó gélen. Az előállítani kívánt, 34 bázispárból álló Hpal-Taql fragmenst elektroelúcióval és etanolos kicsapással különítjük el, majd 5 pl TE-pufferban oldjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22
