202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 A Ti-Tló oligo dezoxi-ribonukleinsavakat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978)]. A különböző oligo dezox- ribonukleotidokat az I. táblázatban adjuk meg. I. táblázat A timozinal gén szintetikus oligonukleotidjai Vegyület Szekvencia Hosszúság HPLC analízis, retenciós idő (perc)* Ti A-A-T-T-C-A-T-G-T-C 10 17,4 T2 T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A 15 24,3 t3 T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A 12 20,3 T4 G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A 13 22,0 T5 G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G 15 24,8 Te G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A 12 20,1 T? A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A 13 22,6 Tg A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T 12 20,2 T9 G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G 12 20,4 T10 A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T 12 21,1 T11 G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T 12 20,5 T12 G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G 12 20,4 T13 C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T 12 19,9 Ti4 T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C 12 20,5 Tis G-T-T-C-T-CAG-C-CT-C 12 20,2 Tl6 G-A-T-C-C-T-A-T-T-A 10 17,2 ♦-szobahőmérsékleten. A mellékelt 12. ábrán foglaljuk össze a T15 fragmens szintézise kapcsán a szintézis módját. Az ábrán számozzuk a T15 fragmens szintézisekor használt különböző nukleotidokat. A rövidítések az alábbiakat jelentik: TPSTe: 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazol; BSA: benzol-szulfonsav; TLC: vékonyréteg-kromatográfia; HPLC: nagyfelbontású folyadék-kromatográfia; DMT: 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport; CE: 2-ciano-etil-csoport; R: p-klór-fenil-csoport; Bz: benzoilcsoport; An: aniszoilcsoport; iBu: izobutirilcsoport; Py: piridin; AcOH: ecetsav, és Et3N: trietil-amin. 85 mg (0,05 mmól) teljesen védett 4 tridezoxiribonukleotidot és 180 mg (0,1 mmól) 2 vegyületet az 5’-hidroxilcsoporton kezelünk a védőcsoport lehasítására. A reakciót úgy végezzük, hogy 2% benzol-szulfonsavval reagáltatjuk a vegyületeket, kloroform és metanol 7:3 arányú elegyében (10 és 20 ml, sorrendben). A reakciót 10 percen át 0 “C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonát-oldatot adunk (2 ml), 25 ml kloroformmal extraháljuk, végül kétszer 10 ml vízzel mossuk az oldatot. A szerves oldószeres fázist magnézium- szulfáttal vízmentesítjük, 5 ml térfogatúra töményitjük, és petroléterrel (35-60 °C-os frakció) kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és csökkentett nyomású térben szárítjuk, így magkapjuk a 6 és 8 számú vegyületet. A tennék a szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat (merek 60 F254, kloroform és metanol 9:1 arányú elegye) homogén. Az 1 és 3 jelű trimerek 270 mg-nyi (0,15 mmól), illetve 145 mg- nyi (0,075 mmól) mennyiségeit az 5 és 7 számú foszfo-diészter- származékaikká alakítjuk át úgy, hogy 25 percen át szobahőmérsékleten trietil-amin, piridin és víz 1:3:1 arányú elegyének 10 ml-ében reagáltatjuk. A reagensek eltávolítására rotavaporban desztillálunk, és a desztillációs maradékot háromszor 10 ml vízmentes piridinnel desztillálva szárítjuk. A 8 (0,05 mmól) és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól) 2,4,6-triizopropil- benzol-szulfonil-tetrazollal vegyítünk 3 ml vízmentes piridinnel készült reakcióelegyben, majd az elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni csökkentett nyomású térben. A vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint a 8 trimer 95%-a hexamerré alakult (úgy állapítjuk meg, hogy a 4,4’-dimetoxi- tritil-csoportot 10%-os, vizes gélsavval permetezzük, és 60 °C-on hevítve láthatóvá tesszük). 1 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A piridint toluolos kiegészítés után desztillálóval távolítjuk el, majd 8 ml 2%-os benzol- szulfonsavval lehasítjuk az 5’-védőcsoportot, ahogy azt a 4 és 2 trimerek előállítása kapcsán megadtuk. A 10 terméket szilikagél oszlopon (Merck 60 H, 3,5x5 cm) tisztítjuk, kloroform és metanol 98:2-95:5 térfogatarányú elegyével végzett gradiens elúcióval. A 10 terméket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk. Hasonlóképpen eljárva, az 5 trimert a 6 jelű vegyülethez kapcsoljuk, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Az utóbbi vegyületet a 3’-végen védőcsoport hasítása céljából a fentiek szerint eljárva trietil- amin, piridin és víz elegyében reagáltatjuk, amikor megkapjuk a 9 jelű ffagmenst. Végül a 9 és 10 hexamereket 2 ml vízmentes piridinben 75 mg (0,225 mól) 2,4,6-triizopropil-benzol-szulfonil-tetrazol kondenzálószer jelenlétében összekapcsoljuk. A reakció 4 óra alatt zajlik le szobahőmérsékleten, ezután az elegyet rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélen kromatografáljuk. A 160 mg súlyú, 11 számú terméket petroléterrel csapjuk ki. A termék a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 20 mg 11 számú vegyületet 0,5 ml piridinben oldunk, és 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal kezelünk a védőcsoportok hasítására. A reakciót 60 'C hőmérsékleten végezzük, 8 órán át. Ezután 15 percen át szobahőmérsékleten 80%- os ecetsav-oldatban kezelünk. Az ecetsavat desztillációval eltávolítjuk, és a szilárd halmazállapotú desztillációs maradékot 4 ml 4%-os, vizes ammónium-hidroxid-oldatban oldjuk, és az oldatot háromszor 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményitjük, és egy részét a 12 vegyület tisztítására nagynyomású folyadék-kromatográfiának vetjük alá. A legnagyobb csúcsnak megfelelő frakciókat összegyűjtjük (2A254 egység), és 5 ml térfogatúra töményitjük. A végső 12 terméket BiO-gélen P-2) kisózzuk (1,5x100 cm méretű oszlop). Az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. Az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
