202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 oldatot szárazra desztilláljuk, és 200 jxl vízben szuszpendáljuk, amikor oldatot kapunk (A254-10). A 12 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvencia-analízissel bizonyítjuk. A teljes timozinal gént 16 szintetikus oligo- nukleotidból állítjuk össze, a szomatosztatin előállítása kapcsán megadottak szerint eljárva [Itakura és munkatársai (1977)], vagy az inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)], vagy a növekedési hormon [Goeddel és munkatársai (1979), Nature, 281, 544] kapcsán leírtak szerint eljárva. 10-10 ug mennyiségű T2-T15 oligo- nukleotidot [gamma-P'2]-adenozin-trifoszfáttal [New England Nuclear] kvantitativen foszforilezünk T4 polinukleotid-kináz jelenlétében [Goeddel és munkatársai (1979)]. A kapott specifikus aktivitás 1 Ci/mmól. A radioaktívan jelzett fragmenseket 20% poliakrilamid/7 mól karbamid gélen elektroforézissel tisztítjuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforetikus homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids Res., 1, 331 (1974)]. Az analitikai méréseket kígyóméreggel részlegesen emésztett termékkel végezzük. A Ti és Ti6 fragmenseket nem foszforilezett alakban használjuk a nemkívánatos polimerizáció csökkentésére, ami a következő ligációs reakció során következhet be. 2-2 jj.g oligo-nukleotidot négy fragmenst tartalmazó négy csoportba kapcsolunk össze (lásd a mellékelt 13. ábrát), a kapcsolást ismert módon T4 dezoxi-ribonukle insav - ligázzal végezzük [Goeddel és munkatársai (1979)]. A reakcióterméket 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen 7 mól karbamid jelenlétében elektroforézissel tisztítjuk [Maxam és Gilbert, PNAS., USA, 77, 3455 (1977)]. A négy izolált terméket ligáljuk, és a reakcióelegyet 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel választjuk szét. A timozinal gén nagyságának megfelelő helyen levő dezoxi-ribonukleinsavat (90-105 bázispár) elektroelúcióval izoláljuk. 0,5 pg pBR322 plazmidot BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakril-amid gél- elektroforézissel szeparáljuk. A nagy fragmenst elektroelúcióval izoláljuk a gélről, és ezután a szintetizált dezoxi- ribonukleinsavhoz ligáljuk [Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)]. A kapott eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk. A transzformációs elegy 5%-át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB lemezeken szélesztjük. A kapott négy, ampicillinre rezisztens telep tetraciklinre érzékeny; ez azt jelenti, hogy a tetraciklin rezisztenciát meghatározó génbe épült be a dezoxi- ribonukleinsav szekvencia. A négy telepből izolált plazmid analízise szerint a pTHal jellel jelzett termék az alábbiakkal jellemezhető: a) tartalmaz egy, a pBR322 plazmidban jelen nem levő Bgin helyet, ami a 11. ábrán bemutatottak szerint a timozinal gén jelenlétére utal, továbbá b) tartalmaz a BamHI-EcoRI hasításkor keletkező körülbelül 105 bázispár nagyságú fragmenst. A pTHal plazmid előállításának sematikus, nem méretarányos ábrázolását a mellékelt 13. ábrán találjuk meg, ahol a vastagon kihúzott vonal az 5’-foszfátcsoportokat jelzi. 3) A kezelt pTHal és az LE’ (d) fragmens reakciója A pTHal plazmid ampicillin rezisztenciát meghatározó gént és egy olyan struktúrgént tartalmaz, amely az 5’-kódoló szál végén az EcoRI helyen és a 3’-vég BamHI helyén a timozinal génnel azonos. A timozingén BglII helyet is tartalmaz. Az LE’(d) fragmenst befogadani képes plazmid előállítására a pTHal plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük, majd dl'IP és dATP jelenlétében Klenow polimeráz I enzimmel az EcoRI végeken tompa végeket alakítunk ki. A kapott terméket BglII enzimmel emésztve olyan lineáris dezoxi- ribonukleinsav fragmenshez jutunk, amely tartalmazza az ampicillin ezisztenciát meghatározó gént, és ellenkező végein egy ragadós BglII szakaszt és egy tompa véget. A termék recirkularizálható egy BglII ragadós véget és egy tompa véget tartalmazó LE’ (d) fragmenssel T4 ligáz jelenlétében, így kapjuk meg a ptrp 24 plazmidot. Ennek érdekében a tompa végligáció helyén EcoRI helyet állítunk elő. E. A pSOM7A2 plazmid előállítása A ptrp24 dezoxi-ribonukleinsavat BglII, majd EcoRI enzimmel hasítjuk, poliakril-amid gélelektroforézist és elektroelúciót végzünk, amikor olyan fragmenst kapunk, amely LE’ (d) polipeptidet leíró kódonokkal, BglII ragadós véggel és 3’-kódoló végének szomszédságában egy EcoRI ragadós véggel rendelkezik. Az LE’ (d) fragmenst a pSOM7 2 plazmid BglII helyére klónozhatjuk, amikor a triptofán promoteroperátor rendszer szabályozása alatt álló, kifejeződő polipeptid-szomatosztatin fúziós proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsavhoz jutunk. Úgy járunk el, hogy 1) a pSOM7A2 plazmidot a triptofán promoteroperátor rendszerhez képest távolabb eső EcoRI hely hasítására részlegesen emésztjük EcoRI enzimmel, majd 2) megfelelően megválasztjuk a primer szekvenciát a kódon megfelelő leolvasási fázisban tartására, és egy EcoRI enzim által felismerhető hely újraalakítására. 16 pg pSOM7A2 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl alábbi összetételű pufferban oldunk: 20 mmól trisz, pH=7,5, 5 mmól magnézium-klorid, 0,02% NP40 detergens, és 100 mmól nátrium-klorid. A dezoxi-ribonukleinsavat 0,5 egység EcoRI enzimmel kezeljük. A reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, majd fenollal, ezután kloroformmal extraháljuk, a terméket etanollal kicsapjuk, és ezután BglII enzimmel emésztjük. A kapott nagyobb fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézissel és elktroelúcióval izoláljuk. Ez a fragmens tartalmazza az „LE’ (p)” kódonokat, mégpedig az LE’ polipeptid proximális végének megfelelő szakaszt. Ez a BglII helytől balra helyzekdik el. Ezt a fragmenst a fentiekben ismertetett LE’ (d) fragmenshez ligáljuk T4 dezoxi- ribonukleinsav ligázzal, amikor a pSOM7A2A4 plazmidot kapjuk meg. Ezt E. coli K12 294 sejtekbe transzformálva olyan fúziós proteint termelő törzshöz jutunk, amely termeli a teljes LE polipeptidet, és a szomatosztatint; mégpedig a triptofán promoter-operátor rendszer szabályozása alatt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
