202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 A találmány tárgya eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására, melynek során ligálunk egy biológiailag aktív szarvasmarha növekedési hormon-származékot kódoló génnel leolvasási fáziban lévő transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát egy „runaway” replikonnal. 1980-ban Miller és munkatársai: De Journal of Biological Chemistry, 255(16):7521 leírták a szarvasmarha növekedési hormon kódoló szekvenciáját. A 047 600 számú európai nyilvánosságrahozatali irat ugyancsak közölte ezt a szekvenciát. Egyik fenti irodalmi hely sem irt azonban le olyan, a jelen találmány szerint alkalmazott szekvenciát, mely szarvasmarha növekedési hormnon-származékokat ismertetett volna, illetve e származékok előállítását sem ismertették. A humán növekedési hormon kódoló szekvenciáját Martial és munkatársai (1979), Science, 205:602 ismertették. Ez az irodalom sem ismerteti azonban a találmány szerint előállított szarvasmarha növekedési hormon-származékokat. Ugyancsak a szarvasmarha növekedési honnon kódoló szekvenciáját és kifejezését ismertette a 2 073 245A számú nagy-britanniai nyilvánosságrahozatali irat, bár a találmány szerinti származékokról ugyancsak nem tettek említést. A 0085 036 számú európai nyilvánosságrahozatali irat szarvasmarhák tejtermelésének fokozására ismertet módszert, szarvasmarha növekedési homon adagolásával, de származékokról ugyancsak nem tesz említést. Seeburg és munkatársai (1983), DNA 2(1):37 szarvasmarha növekedési hormont kódoló módosított DNS szekvenciát tartalmazó plazmidokat ismertet, azonban az ott leírt plazmidok eltérnek a találmány szerinti expressziós vektoroktól. Az 1 557 774 számú brit szabadalmi leírás runaway replikont ismertet, mely kiindulási anyagként alkalmazható a jelen találmány szerinti eljárásban. Ez az irodalom sem ismerteti azonban a találmány szerint létrehozott plazmidokat, származékokat, granulátumokat vagy eljárásokat. Masui és munkatársai, The International Journal of Biology and Industry, January 1984:81 ismertetik az lpp transzkripciós és transzlációs aktiválószekvenciát. Ezt a szekvenciát a találmány szeimti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazzuk. Carrier és munkatársai (1933), Trends in Biotechnology 1(4): 109 runaway replikonokat és különböző termékek, például intracelluláris aggregátumok expresszióját ismertetik rekombináns DNS technikával. A kapott termékek azonban alapvetően eltérnek a leírásban említett granulátumokban található szarvasmarha növekedési hormon-származékoktól. A 095 361 számú európai nyilvánosságrahozatali irat szarvasmarha növekedési hormont tartalamzó kapcsolt terméket kódoló nukleotid szekvenciát ismertet. Ez a kapcsolt termék természetes szarvasmarha növekedési hormonból áll, mely az N-terminális végén enterokinázzal történő hasításra érzékeny aminosavszekvenciát tartalmaz. Ez az irodalom sem ismertet azonban találmány szerinti plazmidokat vagy hormon-származékokat. A találmány új, szelektálható és autonom replikálódó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejező vektorokra vonatkozik. A találmány szerinti vektorok tartalmaznak: 1. biológiailag aktív szarvasmarha növekedési hormon-származékot (bGH) meghatározó génnel leolvasási fázisban levő transzkripciós és transzlációs aktivációs nukleotid szekvenciát, és 2. egy olyan replikont, amely indukált körülmények között elveszti a példányszámot szabályozó képességét. A találmány továbbá a fenti vektorokkal kapott új transzfománsokra, a szarvasmarha növekedési hormon-származékokra és felhasználásukra vonatkozik. A bGH termelését elősegítő rekombináns dezoxiribonukleinsav technológia fejlődését és elterjedését nagymértékben hátráltatja a génkifejeződés problémaköre. A 0075444 számú közzétételi iratban (európai) részletezett problémák közül az egyik a funkcionálisan szuboptimális mRNS transzkripciója. Ennek a mRNS molekulának nyele és hurokszerkezetei léteznek a szekunder konfigurációban, ezek pedig meghatározzák a normális kötődést a riboszómához, és így drasztikus mértékben csökkentik vagy meggátolják a bGH kifejeződését. A jelen szabadalmi leírásban megadottak szerint eljárva megoldhatjuk ezt a problémát úgy, hogy a bGH-származékok kifejezésére nagymértékben képes vektorokat használunk. A leírásban az alábbi, részletesen magyarázott kifejezéseket használjuk. Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor: olyan autonóm replikálódó molekula, például plazmid, amely dezoxi- ribonukleinsav molekulához egy vagy több további dezoxi- ribonukleinsav szegmens kapcsolható, vagy amelyhez ilyen szegmenst kapcsoltunk. Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektor: olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor, amelybe egy vagy több transzikripőciós és transzlációs aktivációs szekvenciát építettünk be. Transzkripciós aktivációs szekvencia: olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a dezoxi-ribonukleinsav átírását hírvivő ribonukleinsav transzkriptummá. Transzlációs aktiváxiós szekvencia: olyan dezoxiribonukleinsav szekvencia, amely szabályozza vagy lehetővé teszi a hírvivő ribonukleinsav transzkriptum átírását egy pepiiddé vagy polipeptiddé. Transzlációs start jel: olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely a transzlációs start kódont határozza meg. Transzlációs stop jel: olyan dezoxi-ribonukleinsav triplet, amely egy transzlációs stop kódont határoz meg. Transzformáció: dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása a recipiens gazdasejtbe, amely ezáltal új genotípust képvisel. Transzformáns: transzformációt szenvedett recipiens gazdasejt. Restrikciós fragmens: egy vagy több restrikciós enzim hatása révén generált lineáris dezoxi-ribonukleinsav szekvencia. Replikon: olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó és expressziós vektorok replikációját szabályozza. Elvesztett (runaway) replikon: olyan replikon, amely elvesztette vagy amely indukálhatván elveszti a példányszámot meghatározó szabályozást, ez a hiány szabályozatlan replikáéi ót eredményez, és annak a dezoxi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
