202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
21 HU 202280 B 22 tűk a fentebb ismertetett módon, s ekkor lehasadt a N-atomban végzódó két lizin, s hasadás következett be a 26-os helyzetű lizin és a 27-e6 helyzetű izoleucin között (2A. ábra). Kívánatosnak találtuk, hogy felépítsük a pUK33trpl03 plazmid egy olyan származékát, amely tetraciklinnel szembeni rezisztenciát kölcsönözhet a gazdasejtjének. A 8. ábrán vázoltuk a pUK33trpl03ApB'TcB plazmid kialakítását. Ezt az alábbiak szerint végeztük: 5 Mg pHGH207-l plazmidot (lásd alább) emésztettünk Hpal és PvuII enzimekkel. A vektor töredéket elkülönítettük és tisztítottuk. 5 Mg pUK33trpl03 plazmidot emésztettünk Hpal és BamHI enzimmel, elektroforézist végeztünk 6%-os poliakrilamid-gélen, és a 836 bázispárból álló DNS töredéket megtisztítottuk. A pUK33trpl03 plazmid egy másik 5 Mg mennyiségű alikvot részét emésztettük BamHI és PvuII enzimmel, s elkülönítettük és tisztítottuk a 119 bázispárból álló DNS töredéket. Mindhárom kapott DNS töredék ekvimoláris mennyiségét összekapcsoltuk egy éjszakén át 14 °C-on, és felhasználtuk az Escherichia coli 294 törzs transzformálására. A különböző, ampicillinnel szemben rezisztens transzformációs termékekből nyert plazmid DNS restrikciós endonukleázokkal végzett analízise megerősítette a pUK33trpl03ApB plazmid megfelelő szerkezetét és a DNS-t kódoló trp promotor/UK33 irányítottságának megfordulását. Körülbelül 5 Mg pBR322 DNS-t emésztettünk EcoRI enzimmel, és az összetartó végeket kitöltöttük Klenow polimeráz 1-gyel. PstI enzimmel végzett emésztés utón elkülönítettük és tisztítottuk a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát, a reprodukció eredetét és az ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztositó gén egy részét kódoló DNS-t tartalmazó nagy vektor töredéket. Mintegy 5 Mg pUK33trpl03 ApB plazmidot emésztettünk BamHI és PstI enzimekkel. Tisztítottuk azt a DNS töredéket, amely a trp promotort, az ampicillinnel szembeni rezisztenciát biztositó gén fennmaradó részét és a kis molekulatömegű urokináz legnagyobb részét kódolja. E két DNS töredék és a pUK33trpl03ApB plazmidból kapott, 119 bázispárból álló BamHI - PvuII DNS töredék közelítőleg ekvimoláris mennyiségét összekapcsoltuk egy éjszakán át 14 °C-on, és ily módon befejeztük a pUK33trpl03ApBTcB plazmid kialakítását. Ezt a plazmidot felhasználtuk egy olyan plazmid létrehozásához, amelynél a cél a nagymolekulatömegű teljes hoszszúságú urokináz termelése volt (lásd a kővetkező részt és a 9. ábrát). Nagy molekulatömegű urokináz-származékok termelése Az 54 kdalton molekulatömegű urokináz közvetlen termelése A 9. ábrán mutatjuk be a teljes hosszúságú urokináz kialakitását. Az egyetlen trp-promotorral rendelkező pHGH207-l plazmidot úgy kaptuk, hogy a kettős lac-promotort eltávolítottuk a pHGH 207 plazmidból, amely kettős lac-promotort, majd utána egyetlen trp-promotort tartalmaz. Ezt a következőképpen végeztük el: A trp-promotor 310 bázispárból álló DNS töredéket pFIF trp 69 plazmidból (20) nyertük EcoRI enzimmel végzett emésztéssel. Ezt a töredéket beillesztettük a pHGH 107 plazmidba (44), amelyet előzetesen felnyitottunk EcoRI enzimmel. Ezáltal olyan plazmidot (pHGH 207) kaptunk, amelyben kettős lac promotor található, azt a trp-promotor követi, és a szomszédsában EcoRI helyek vannak. Az így nyert pHGH 207 plazmidot feltártuk BamHI enzimmel. Ezt részlegesen emésztettük EcoRI enzimmel, és a legnagyobb töredéket elkülönítettük. Ezért ez a töredék rendelkezik az egész trp-promotorral. A pBR322 plazmidból elkülönítettük a legnagyobb EcoRI - BamHI töredéket. A két fenti töredéket összekapcsoltuk, és a termékkel transzformáltuk az Escherichia coli 294 törzset. Tetr, Ampr (tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztens) tenyészeteket különítettünk el, és ezek legtöbbje olyan plazmidot tartalmazott, amelynek a szerkezete megegyezett a pHGH207-l plazmidra kimutatott szerkezettel. A pHGH207-l plazmid tehát a pHGH107 plazmid (44) egy származéka, s az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: 1) az emberi növekedési hormon (HG) génjét a triptofán promotor előzi meg, s nem a lac-promotor, mint a pHGH107 plazmid esetén. 2) A plazmid ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosit, amikor Escherichia coli törzsben termeljük. (Lásd a 47A szakirodalmi helyet is). 20 Mg pHGH207-l plazmidot részlegesen feltártunk EcoRI restrikciós endonukleézzal, és teljesen emésztettük BglII restrikciós endonukleázzal. A nagy vektor töredéket 5%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel, elektroelúcióval, fenolos és kloroformos extrakcióval, majd etanolos kicsapással tisztítottuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 13
