202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
23 HU 202280 B 24 14 ng pFl plazmidot feltártunk BglII és Taql enzimekkel, elkülönítettük a 236 bázispárból álló DNS töredéket, és 6%-os poliakrilamid gélből tisztítottuk. A következő kiegészitó DNS töredékeket szintetizáltuk a foszforsav-triészteres módszerrel (47): MetSerAsnGluLeuHisGlnValPro 5’ AATTATGAGCAATGAATTACATCAAGTTCCAT TACTCGTTACTTAATGTAGTTCAAGGTAGC 5’ Amint jeleztük, a Met Ser Asn Glu Leu His Gin Val Pro aminosav-szekvenciának megfelelő DNS szekvencia kódolja az ATG beindító kodont és a nagy molekulatömegű urokináz amino terminálisán levő nyolc «minosavat. Mindegyik szintetikus DNS töredék 50 ng mennyiségét foszforileztük, a töredékeket összekevertük, 1 percig 65 °C-on melegítettük, majd hagytuk, hogy 5 perc alatt szobahőmérsékletre lehűljön. A foszforilezett és összekevert szintetikus DNS töredékek 10 ng mennyiségét 14 °C-on egy éjszakén át összekapcsoltuk mintegy 200 ng részleges EcoRI, BglII pHGH207-l vektor töredékkel és körülbelül 50 ng mennyiségű, 236 bézispérból álló BglII - Taql DNS töredékkel, és a terméket Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk. Huszonnégy, ampicillinnel szemben rezisztens tenyészetből származó egyes plazmidok dezoxiribonukleinsavját emésztettük EcoRI és BglII enzimmel, s a megfelelő szerkezetet mutató egyik plazmidot (pinti) választottuk ki a DNS-szekvencia analíziséhez. Ez az analízis igazolta a helyes DNS-szekvenciát a nagy molekulatömegü urokinéz ATG beindító kodonján és aminovégcsoportú részén keresztül. 4 Mg pNCV plazmidot (lásd az előző részt) emésztettünk BglII és Clal enzimekkel, a nagy vektor töredéket elkülönítettük és 5%-os poliakrilamid-gélből tisztítottuk. 30 Mg pFl plazmidot feltártunk PstI és BglII enzimekkel, majd elektroforézist végeztünk 6%-os poliakrilamid-gélen keresztül. A 44 bézispárból álló DNS töredéket elektroelúciónak vetettük alá, fenollal és kloroformmal extraháltuk és etanollal kicsaptuk. 4 ng pA3 DNS-t feltártunk PstI és Taql enzimekkel, és a 192 bázispárból álló DNS töredéket 6%-os poliakrilamid gélből tisztítottuk. 100 ng mennyiségű BglII - Clal vektor DNS töredéket, 50 ng mennyiségű, 192 bázispárból álló töredéket és 50 ng mennyiségű, 44 bázispárból álló töredéket összekapcsoltunk egy éjszakánt át 14 °C-on, majd Escherichia coli 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformációval kapott, különböző, tetraciklinnel szemben rezisztens termékekből kapott plazmid DNS BglII és Clal enzimekkel végzett kétszeres emésztése, megmutatta ennek az új plazmidnak (plnt2) a helyes szerkezetét. Escherichia coli GM48 törzsben (ATCC 39099, a deponálás ideje 1982. április 9.) termelt pUK33trpl03Ap*Tc® plazmid 5 Mg menynyiségét feltártuk Bell és Sail enzimekkel, s elkülönítettük és tisztítottuk az 1366 bázispárból álló DNS töredéket. Ugyanebből a plazmidból elkülönítettük a 108 bázispárból álló EcoRI - Bell töredéket. A pUK33trpl03- Ap*Tc* plazmidból származó Sáli - Bell, és az ugyanebből a plazmidból származó EcoRI - Bell töredék, valamint a plnt2 plazmidból származó EcoRI - Sáli töredék közel ekvimoláris mennyiségét összekapcsoltuk 14 °C hőmérsékleten egy éjszakén át. Ily módon a plnt3 plazmidot kaptuk. 5 Mg plnt3 DNS-t BglII és Sáli enzimekkel emésztettünk, elektroforézist végeztünk 6%-os poliakrilamid-gélen, és az 1701 bázispárból álló töredéket tisztítottuk, amely a teljes hosszúságú urokináz karboxil-végcsoportú részét és a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén aminovégcsoportú részét tartalmazta. Körülbelül 5 Mg pinti DNS-t feltártunk BglII és Sáli enzimekkel, elektroforézist végeztünk 6%-os poliakrilamid-gélen keresztül, és a nagy vektor töredéket tisztítottuk, amely a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén karboxil-végcsoportú részét, a reprodukció eredetét, az ampicilinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént, a trp promotort, az ATG beindító kodont és a teljes hosszúságú urokináz aminovégcsoportú részét tartalmazta. 100 ng körüli mennyiségű vektor töredékhez hozzáadtunk körülbelül 100 ng mennyiségű, 1701 bázispárból álló töredéket, összekapcsoltuk őket egy éjszakán át 14 °C-on, és a termékkel Escherichia coli 294 törzset transzformáltunk. Egy tetraciklinnel és ampicillinnel szemben rezisztens tenyészetből származó olyan plazmidot azonosítottunk, amely a megfelelő képet adta Pvull restrikciós endonukleázzal végzett analízisnél. A vizsgálat megerősítette a teljes hosszúságú urokináz szerkezetét a trp promoter után. Ez az azonosított plazmid a pUK54trp207-l. Teljes hosszúságú urokinázt kapunk, ha ezt a plazmidot Escherichia coli 294 törzsben termeljük. Az 54 kdalton molekulatömegü eló-urokináz (Pre-UK) közvetlen termelése Escherichia coli törzsben (10. ábra) Az alábbi eljárás szerint építettünk fel egy olyan plazmidot, amely az 54 kdalton molekulatömegű eló-urokináz (preUK54) közvetlen termelésére alkalmas. A foszforsav-triészteres módszerrel (47) két kiegészítő DNS töredéket szintetizáltunk, amelyek az ATG aminosav-szekvencia beindító kodont kódolják. Ezt követi az urokináz előszekvencia első három, nitrogénvégcsoportú aminosavja (Arg Ala Leu) az alábbiak szerint: EcoRI MetArgAlaLeu BglI 5’ AATTATGCGTGCCCTGC TACGCACGGG 5’ Az előszekvencia ezen részének szomszédságában helyezkednek el az EcoRI és BglI 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
