202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
49 HU 202279 B 50 pPS6 plazmidot feloldunk 20 pl 10 x Amal reakciópufferban (250 mmól/liter NaCl; 100 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 100 mmól/liter MgCh; 100 mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA) és 165 pl HzO-ban. Mintegy 15 pl (30 egység) Amal restrikciós enzimet adunk a pPS6 DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. Az A'mal-el emésztett pPS6 plazmid DNS-L lX-os agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amig a - 3,7 kb-s Amal restrikciós fragmens tisztán elkülönül a többi emésztési terméktől. A - 3,7 kb-s A'mal restrikciós fragmenst azután izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban. Mintegy 5 pg kívánt ~ 3,7 kb-s Amal restrikciós fragmenst nyerünk, ezt felszuszpendáljuk 10 m1 H20-ban. B. A pPS30 és pPS30.1 plazmidok végsó megalkotása Mintegy 1 pg pPS21A plazmid DNS-t feloldunk 2 ul 10 x Amal reakciópufferban és 6 m1 HíO-ban. Mintegy 2 ul (6 egység) Amal restrikciós enzimet adunk a pPS21A plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 órán át. A reakciót pufferolt fenollal végzett extrahálással állítjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A reakciókeveréket ezután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és 23 pl H20-ban újra szuszpendáljuk. A pPS6 plazmid ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmenséböl mintegy 2 pl-t, 3 pl 10 x ligáz puffert és 2 pl T4 DNS ligázt adunk az Amal-el emésztett pPS21A plazmid DNS-hez, és az igy létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS30 és PPS30.1 plazmidokat, amelyek egymástól csupán a - 3,7 kb-s A'mal restrikciós fragmens orientációjában különböznek. A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 C600 transzformálására, lényegében a 7. példa eljárásával összhangban. Az E. coli K12 C600/pPS30 és E. coli K12 C600/pPS30.1 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotipusok alapján és plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzése alapján azonosítjuk. A pPS30 és pPS30.1 plazmidokat használjuk Cephalosporium acremonium transzformálására is. A C. acremonium/pPS30 és C. acremoníum/pPS30.1 transzformánsok rezisztensek higromicinre. C. A pPS31 és pPS31.1 plazmidok végső megalkotása A pPS31 és pPS31.1 plazmidokat megalkotjuk és E. coli K12 C600-ba, illetve Cephalosporium acremoniumba transzformáljuk, lényegében a 10B. példa eljárásával összhangban, azzal a különbséggel, hogy a pPS21A plazmid helyett a pPS29 plazmidot alkalmazzuk, mint kiindulási anyagot a megalkotásban. 11. példa A pPS27 plazmid megalkotása A. A plT336 plazmid megalkotása Mintegy 1 pg pUC8 plazmidot feloldunk 2 ul 10 x BamHI reakciópufferban és 16 ul HíO-ban. Mintegy 2 pl (20 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a pUC8 plazmid DNS oldatához, és az Így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk két órán át. A BamHl-vel emésztett pUC8 plazmidot kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 2 pl 10 x SaR ciópufferban (1,5 mól/liter NaCl; 60 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,9; 60 mmól/liter MgCb; 60 mmól/liter 2-merkapto-etanol; és 1 mg/ml BSA) és 16 pl HzO-ban. Mintegy 2 pl (20 egység) Saü restrikciós enzimet adunk a BamHI-vel emésztett pUC8 plazmid DNS-hez, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten két órán át inkubáljuk. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le, ezt követi két extrakció kloroformmal. A Safl- BamHI-emésztett pUC8 plazmid DNS-t kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 5 pl HzO-ban. Mintegy 10 pg pIT335 plazmidot feloldunk 10 pl 10 x BamHI reakciópufferban és 80 pl H20-ban. Mintegy 5-5 pl (50 egység) Ahol és BamHI restrikciós enzimet adunk a plT335 plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A reakciókeveréket ezután IX agaróz gélre terheljük és elektroforézisnek vetjük alá, amig a ~ 1,4 kb-s BamHI-AhoI restrikciós fragmens elkülönül a többi reakcióterméktől, ezek az 5,6 kb-s, 1,3 kb-s és 0,01 kb-s fragmensek. A ~ 1,4 kb-s BamHI-AhoI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS gén átírás-befejező és mRNS poliadenilező és műveleti szignáljait, izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban. Mintegy 2 pg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 5 pl HzO-ban szuszpendáljuk. A SaŰ-BamHI-emésztett pUC8 plazmid 5 pl-ét hozzáadjuk a pIT335 plazmid - 1,4 kb-s BamHI-AhoI restrikciós fragmensének 2 pl-éhez, 3 pl 10 x ligáz pufferhoz, 18 pl HzO-hoz, és 2 pl T4 DNS ligázhoz. Az igy létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A SaR és Ahol átfedések összeférhetők ligáláshoz, de ha egyszer ligáltunk, sem a SaR, sem az Ahol nem hasítják a DNS-t az elágazásoknál. A ligáit DNS alkotja a kívánt pIT336 plazmidot és ezt használjuk E. coli K12 RR1aM15 transzformálására, lényegében a 7A. példa (i v) részének eljárásával összhangban. A 27 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 65
