202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
51 HU 202279 B 52 fenti E. coli törzs az NRRL törzsgyűjteménynél áll rendelkezésre NRRL B-15440 letéti számon. A transzformált sejteket L-agar lemezekre szélesztjük, amelyek még 100 pg/ml ampicillint, 40 Mg/ml X-gal-t és 40 Mg/ml IPTG-t tartalmaznak. Azokat a telepeket, amelyek nem mutatnak kék szint a transzformáló lemezeken, tenyésztjük, felhasználjuk plazmid DNS készítésére, és a plazmid DNS-t restrikciós enzimes elemzéssel elemezzük, hogy azonosítsuk az E. coli K12 RR1aM15/pIT336 transzformánsokat. A pIT336 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 14. ábra mutatja be. B. A pPS35 plazmid megalkotása Mintegy 2 Mg pIT36 plazmidot feloldunk 2 pl 10 x PstI reakciópufferban és 17 m1 H20-ban. Mintegy 1 m1 (10 egység) Psű restrikciós enzimet adunk a pIT336 DNS oldatéhoz, és az így létrejött reakciókeveréket inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 2 őrén ét. A reakciót fenollal végzett extrakcióv&l állítjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A Pstl-el emésztett pIT336 plazmid DNS-t azután kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 86 m1 HiO-ban. Mintegy 10 pl 10 x ligáz puffert és 4 pl T4 DNS ligázt adunk a Pstl-el emésztett pIT336 plazmid DNS-hez, és az igy létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 15 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS35 plazmidot, ezt használjuk E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében a 7A. példa (iv) részének eljárásával összhangban. A fenti törzs az NRRL-nál rendelkezésre áll, NRRL B 15211 letéti számon. A transzformált sejteket L-agar lemezekre szélesztjük, amely lemezek tartalmaznak 100 pg/ml ampicillint is. Több ampicillin-rezisztens telepet izolálunk és használunk fel plazmid DNS készítésére. A kívánt E. coli K12 JA221/pPS35 transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével azonosítjuk. A pPS35 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 15. ábra adja meg. C. A pPS27 plazmid végső megalkotása Mintegy 2 pg pPS35 plazmidot feloldunk 2 pl 10 x fíindlll reakciópufferban és 17 pl H20-ban. Mintegy 1 pl (10 egység) WindllI restrikciós enzimet adunk a pPS35 plazmid DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A reakciót fenolos extrahálással állítjuk le, ezt követi két extrahálás kloroformmal. A Hindlll-al emésztett pPS35 plazmid DNS-t ezután kicsapjuk, centrifugálással öszszegyűjtjük és 3 pl 10 x ligáz pufferban és 23 pl HzO-ban újra szuszpendáljuk. A pPS29 plazmid - 2,3 kb-s 7/fndIII restrikciós fragmensének, amelyet lényegében a 9. példa eljárásával összhangban állítunk elő azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként pPS29-et alkalmazunk pPS21A helyett, és amely tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciája által elősegített higromicin rezisztencia átadó gént, 2 pl-ét, valamint 2 pl T4 DNS ligázt a HindIII-td emésztett pPS35 plazmid DNS oldatához adjuk. Az így létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS27 plazmidot, ezt használjuk E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében a 11B. példa eljárásával összhangban. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat tenyésztjük és plazmid DNS készítésére használjuk fel, amelyet restrikciós enzimes elemzésnek vetünk alá, hogy azonosítsuk a kivánt E. coli K12 JA221/pPS27 transzformánsokat. A beiktatott ~ 3,45 kb-s HindlII restrikciós fragmensnek csak az egyik orientációja termeli a kivánt pPS27 plazmidot. A pPS27 plazmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra adja meg. A pPS27 plazmid higromicin-rezisztens fenotipusúvá transzformálja a Cephalosporium acremoniumot nagy gyakorisággal. A C. acremonium/pPS27 transzformánsokat lényegében a 6. példa eljárásával összhangban állítjuk elő. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 28
