202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
43 HU 202279 B 44 ri-csészéket 15 °C hőmérsékleten 24 őrén át inkubáltuk, 4 ml folyékony agart (0,41 tömeg/térfogat X, 42 °C hőmérsékleten), amely 0,8 mól) liter nátrium-kloridot és 100 pg/ml végső koncentráció elérésére elegendő higromicint tartalmaz, adunk az egyes Petri-csészékhez. Miután a felső réteg megszilárdult, a Petri-csészéket 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk nedvesített kamrában. Bár az altenyészetekhez való megfelelő méretű transzformans telepek 12 nappal a transzformálás után már jelen vannak, a transzformánsok lassú növekedése eltarthat akár 60 napig is, hogy elérjük az altenyészetekhez alkalmas megfelelő méretet. A korcs transzformánsok könnyen megkülönböztethetők a stabil transzformánsoktól, mivel a korcs transzformónsok nem növekednek altenyészeteken olyan friss tápközegeken, amelyek 100 pg/ml higroinicint tartalmaznak. G. Cephalosporium acremonium/pPS20 és C. acremonium pPS21 transzformánsok elemzése A Cephalosporium acreraonium/pPS20 transzformánsok szignifikánsan nagyobb szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetáz aktivitást, mint a kontroll plazmidok C. acremonium transzformánsai, mint pl. a pIT221 plazmid. Ez a magasabb aktivitási szint a transzformánsok megnövekedett képességét eredményezi izopenicillin N előállítására, akár fermentáció folyamán, akár a C. acremonium/pPS20 transzformánsok sejtextraktumaiban. A Cephalosporium acremonium/pPS21 transzformánsok higromicin-rezisztensek, amelyek jelzik a jelen találmány szerinti C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia működőképességét. 7. példa A pPS21A, pPS22, pPS23.1, pPS24, pPS25, és pPS2ő.l plazmidok megalkotása A. A pPS23 és pPS23.1 köztes plazmidok megalkotása (i) BamHI-vel emésztett pUC8 plazmid előállítása Mintegy 5 pg pUC8 plazmidot (amelyet a Pharmacia P-L Biochemicals-tól kaphatunk) feloldunk 5 pl 10 x BamHI reakciópufferban és 40 pl H20-ban. Mintegy 5 pl (50 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A reakciót pufferolt fenollal extrahálva állítjuk le, ezt követi a kloroformos extrahálás. A BamHI-val emésztett pUC8 DNS-t úgy csapjuk ki, hogy 0,25 mól/liter koncentráció eléréséig NaCl-t adunk hozzá, majd két térfogat etanolt, és a keveréket -70 °C hőmérsékleten hütjük 10 percen ét. A BamHI-el emésztett 24 pUC8 plazmid DNS-t centrifugálással összegyűjtjük és 5 pl HzO-ban újra szuszpendáljuk. (ii) A plT335 plazmid ~ 0,85 kb-s Ncol fragmensének izolálása Mintegy 10 ug pIT335 plazmidoL feloldunk 5 pl 10 x BamHI pufferban és 40 pl H20-ban. Mintegy 5 pl (50 egység) Ncol restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán ét. A reakciókeveréket ezután 1%-os agaróz gélre terheljük, és a kívánt ~ 0,85 kb-s Ncol restrikciós fragmcrist, amely tartalmazza az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, izoláljuk, lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban. Mintegy 1 pg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 5 pl HzO-ban szuszpendáljuk. (iii) A pPS23 plazmid megalkotásában használt kapcsoló (linker) előállítása A következő kapcsoló egyes szálait szintetizáljuk, automatizált DNS szintetizátort alkalmazva. 5’ - CATGAAGAAG-3’ 3’ - TTCTTCCTAG-5' A kapcsoló egy szálából 75-75 pikomólt egyenként feloldunk 22,5 pl HíO-ban é6 2,5 pl ligáz-pufferban. Mintegy 1 pl (10 egység) T4 DNS kinázt (Bethesda Research Laboratories) adunk az egyszálú DNS-ek mindegyik oldatához, és a reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át. A kinéz reakciót követően a reakciókeveréket 70 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. Ezután, hogy az egyszálú DNS-eket öszszeforrasszuk a kapcsoló kialakítása érdekében, a két reakciókeveréket egyesítjük, 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át, majd szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk, végül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. (iv) A pPS23 és pPS23.1 plazmidok végső megalkotása 1 pl BamHI-vel emésztett pUC8 plazmid DNS-t adunk egy olyan keverékhez, amely 4 pl pIT35 plazmid ~ 0,85 kb-s Ncol restrikciós fragmensből és 10 pl Ö6szeforrasztott kapcsolóból áll. Mintegy 4 pl 10 x ligáz puffert, 2 pl (500 egység) T4 DNS ligázt és 29 pl HíO-t adunk a DNS keverékhez, és az így létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS23 és pPS23.1 plazmidokat. E. coli K12 JM109 (amely a Pharmacia P-L Biochemicals-nál rendelkezésre áll) 50 ml-es tenyészetét L-tápközegben növesztjük, amíg a mintegy 0,5 abszorpciós egység értéket O.D.590-re el nem érjük. A tenyészetet jégen hütjük 10 percen át, és a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml hideg, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
