202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
100 mmól/literes CaCh oldatban, és jégen in- juk. A DNS-t ezután kicsapjuk, centrifugákubáljuk 25 percen át. A sejteket még egy- lássál összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk szer üledékbe visszük centrifugálással, és az 10 ul HíO-ban. üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml hideg, 45 HU 202279 B 46 100 mmól/literes CaCk oldatban, majd egy 5 éjszakán át jégen inkubáljuk. Ebből a sejtszuszpenzióból 200 ul-t öszszekeverünk a fentebb készitett ligáit DNS-el, és jégen inkubáljuk 20 percen át. Ennek az időszaknak a végén a sejteket 42 °C hő- 10 mérsékletű vízfürdőbe helyezzük 2 órára, majd visszatesszük jégre további 10 percre. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 1 ml L-tápközegben, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. 15 A sejtkeverék alikvotjait L-agar lemezekre (L-tápközeg 15 g/liter agarral) szélesztjük, a lemezek 100 ug/ml ampicillint, 40 jug/ml X-gal-t és 40 ug/ml IPTG-t is tartalmaznak. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 20 inkubáljuk egy éjszakán át. A telepek, amelyek beiktatott rész nélküli plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 JM109/pUC8, kéknek látszanak ezeken a lemezeken. Azok a telepek, amelyek beiktatott résszel rendelke- 25 zó plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 JM109/pPS23, fehérek. Számos fehér telepet választunk ki és vizsgálunk át az IPS aktiváló szekvenciát tartalmazó - 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmens jelenlétére, plaz- 30 mid DNS-eik restrikciós elemzése alapján. A plazmid DNS-t az E. coli K12 JM109/pPS23 és E. coli K12 JM109/pPS23.1 sejtekből nyerjük ki, lényegében a 2A. példában található kitanitáss&l összhangban. 35 B. A pPS23 plazmid ~ 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmensének izolálása Mintegy 50 Mg pPS23 plazmid DNS-t fel- 40 oldunk 15 m1 10 x BamHI reakciópufferban és 125 ul HzO-ban. Mintegy 10 ul (100 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, és az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A 45 BfimHI-vel emésztett pPS23 plazmid DNS-t IX-os agaróz gélre terheljük, és a - 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS gén aktiváló szekvenciáját, izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával 50 összhangban. Mintegy 5 Mg kívánt fragmenst nyerünk, ezt 10 jul vízben szuszpendáljuk. C. BamHI-el emésztett pPS19 DNS előállítása 55 Mintegy 5 Mg pPS19 plazmid DNS-t feloldunk 10 ul 10 x BamHI reakciópufferban és 35 ul HzO-ban. Mintegy 5 ul (60 egység) BamHI restrikciós enzimet adunk a pPS19 plazmid DNS oldatához, és az így létrejött g0 reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A BamHI-el emésztett pAS19 plazmid DNS reakciókeverékét egyszer pufferolt fenollal, majd kétszer fenollal extrahál-D. A pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 es pPS25.1 végső megalkotása Mintegy 1 ul ~ 0,85 kb-s BamHI restrikciós fragmenst adunk 1 ul, BamHI-vel emésztett pPS119 plazmid DNS-hez, 3 ul 10 x ligáz pufferhoz, 2 ul T4 DNS ligázhoz, és 23 ul H20-hoz. Az így létrejött reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 és pPS25.1 plazmidokat. A ligáit DNS-t használjuk fel E. coli K12 C600 törzs transzformálására, lényegében a 7A példa (iv) fejezetében található eljárással összhangban. Az alkalmazott E. coli törzs az American Type Cultura Collection-nál (Rockville, Maryland 20852) rendelkezésre áll az ATCC 33525 letéti szám alatt. A transzformált sejteket L-agar lemezekre, amelyek 100 ng/ml ampicillint is tartalmaznak, helyezzük és a lemezeket 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A transzformációs lemezekről egyedi telepeket szúrunk fel, tenyésztjük ezeket, és felhasználjuk ezeket plazmid DNS előállításéra. A plazmid DNS-t restrikciós enzimes analízissel elemezzük. A következő táblázat mutatja be a megfelelő restrikciós enzimes emésztéseket, amelyeket lehet használni, hogy megkülönböztessük a plazmidokat. Plazmid Enzim A fragmensek (kb-ban) méretei pPS19 BamHI 7,62 és 0,23 Pstl 5,15; 1,85 és 0,85 pPS21A BamHl 7,62 és 0,85 Psü 5,15; 1,85; 0,99 és 0,49 pPS22 BamHI 7,62 és 0,85 Pstl 5,15; 1,85; 0,94 és 0,54 pPS24 BamHI 7,62 PstI 7,62 pPS25 és BamHI 5,15; 1,85; 0,99 és 0,72 pPS25.1 Pstl 7,62; 0,85 és 0,23 A pPS21A illetve pPS25 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 8. illetve 9. ábrák mutatják be. A pPS21A, pPS25.1 és pPS25 plazmidokat Cephalosporium acremonium transzformálására alkalmazzuk, lényegében a 6. példa eljárásával összhangban. A C. acremonium/pPS21A, C. acremonium/pPS25.1 és C. acremonium/pPS25 transzformánsok higromicin-rezisztensek. A 25
