202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
41 HU 202279 B napon át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten. Mintegy 10 ml fenntartó tápközeget (lásd fentebb) adunk a micéliumosan növekvő tenyészethez, amely elfedi a tápközeget az egyes ferde agar tenyészetekben. A ferde 5 agar tenyészeteket Vortex-berendezésen homogenizáljuk, hogy a konidiumokat felszuszpendáljuk, és az egyes ferde agarokból származó konidiális szuszpenziókat egyesitjük, majd ebből 10 ml-es alikvotokat fa- 10 gyasztunk le -80 °C hőmérsékleten. A lefagyasztott konidiális szuszpenzió lassan elveszti életképességét, és ezért nem szabad felhasználni mintegy három hónapos, -80 °C-on végzett tárolás után. 15 D. A sejtek növesztése protoplaszt készítéséhez Mintegy 106 ml vizes tápközeget, amely 20 500 ml-es rázólombikban található, inokulálunk 10 ml, 6C. példa szerint előállított, fagyasztott konidiális szuszpenzióval. A sejteket centrifugálással (10 perc, 2600 fordulat/perc) nyerjük ki, majd közvetlenül szusz- 25 pendáljuk a vizes tápközegbe (összetételét lásd alább). A felülúszó dekantálása a szuszpendálás előtt szükséges, mivel a laktóz és a glicerin ellentétesen hatnak a sejtek növekedésére. A szuszpendált sejteket tartalmazó 30 lombikot forgó, vízfürdős rázógépre helyezzük, és 29-30 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk, a rázógép fordulatszáma 285 fordulat/perc, a kitérés 2,54 cm. A 29-30 °C ajánlott hőmérséklet különösen előnyös a 35 transzformálható protoplasztok készítéséhez, de alacsonyabb, pl. 25 °C hőmérséklet szintén megfelelő. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a 29-30 °C hőmérséklet eltér attól a hőmérséklettől, amelyet a 40 Cephalosporium acremonium tenyésztéséhez alkalmaznak az antibiotikum-termelés céljaira (25 °C). A fenti vizes tenyésztő tápközeget a következőképpen készítjük el: 100 ml A olda- 45 tot bemérünk egy 500 ml-es rázólombikba; a lombikot kereskedelemben kapható zárósapkával lefedjük és 121 °C hőmérsékleten 20 percig autoklávozzuk. 2 ml B oldatot és 4 ml C oldatot adunk ez után az A oldathoz, igy 50 kapjuk meg a vizes tenyésztő tápközeget. A oldat 36 g/liter szacharóz; 7,5 g/liter L-aszparagin; 15 g/liter KHzPO«; 21 g/líter K2HPO4; 0,75 g/liter Na2S0<; 0,18 g/liter MgSO«.7HzO; 0,06 g/liter CaCte; 1 ml/liter só- 55 oldat, természetesen beálló pH. A sóoldat összetétele: 15 g/liter FelNHí) (SC>4)2.6HzO; 3 g/liter MnS04.4Hz0; 3 g/liter ZnS04.7Hí0; 0,8 g/liter CuS04.5H20. B. oldat: 108 g/liter glükóz (121 °C hőmér- 60 sékleten 30 percig autoklávozva). C. oldat: 25 g/liter szacharóz; 12,5 ml kukoricalekvár (4 súly/térfogat% nitrogén); 5,5 g/liter ammónium-acetát; 5 g/liter CaCCte, a pH KOH-val 6,5-re beállítva; autoklávozva 65 121 °C hőmérsékleten 20 percen át. E. Cephalosporium protoplasztok készítése 24 órás tenyészetből sejteket nyerünk ki szívással végzett szűréssel (Whatman N- 1 papír, Büchner-tölcsérben), és Mcllvaine pufferben szuszpendáljuk, pH = 7,1 (0,1 mól/liter citromsav és 0,2 mól/liter dinátrium-hidrogén-foszfát), amelyhez ditiotreitolt is adunk 0,01 mól/liter koncentrációban. Annyi puffert adunk hozzá, hogy a végső sejtkoncentráció (a leszívott szűrlet lemérése után) 1 g sejtmassza/20 ml puffer legyen. A sejtszuszpenziót forgó, vízfürdős rázógépen elhelyezett 50 ml-es rázólombikba helyezzük, és 29-30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 90 percen keresztül, 140 fordulat/percnél, 2,54 cm kitéréssel. A ditiotreitollal kezelt sejteket vízzel mossuk, majd újra szuszpendáljuk enzimoldatban [25 mg/ml béta-glükuronidáz (Sigma Chemical Company) Mcllvaine pufferban, pH = 6,35, kiegészítve 0,8 mól/liter NaCl és 0,02 mól/liter MgSC>4 koncentrációra). A végső sejtkoncentráció 1 g kezelt sejttömeg/10 ml enzimoldat. A sejtszuszpenziót forgó, vízfürdős rázógépre helyezzük, és 29-30 °C hőmérsékleten rézatjuk 3 órán át, 120 fordulat/percnél, 2,54 cm kitéréssel. A protoplasztok szuszpenzióját 4 térfogat mosóoldattal (0,8 mól/liter NaCl, 0,02 mól/liter MgS04) hígítjuk, azután csak a nehézségi erő segítségével szűrjük két réteg papirtörölközőn át. A protoplasztokat tartalmazó szűrletet szobahőmérsékleten 5 percen ót centrifugáljuk 2600 fordulat/perccel. A felülűszót dekantáljuk, és a protoplasztok üledékét 10 ml mosóoldatban szuszpendáljuk. A mosási eljárás kétszeri megismétlése után a protoplasztokat újra szuszpendáljuk annyi 0,8 mól/literes NaCl oldatban, hogy elérjük a 2-3.10h protoplaszt/ml koncentrációt, a sejtszámot hemacitometerrel számolva. F. Transzformációs folyamat Minden transzformálandó plazmidhoz 1 ml Cephalosporium protoplaszt szuszpenziót (0,8 mól/literes NaCl-ben) adunk 0,005 ml frissen desztillált DMSO-hoz, (dimetil-szulfoxid) és a keveréket CaClz-re 80 mmól/literessé tesszük. Mintegy 20 jug transzformáló plazmidot, vagy pPS20-at, vagy pPS21-et (a transzformálástól függően) és polietilénglikol 4000-t (Baker, >20 tőmeg/térfogat vízben) adunk a protoplasztok szuszpenziójához, hogy 10 ml keveréktérfogatot érjünk el. A keveréket 10 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd 700 fordulat/percnél centrifugáljuk 5 percen át, ezt követi egy centrifugólás 2500 fordulat/percnél 10 percen át. A protoplasztok üledékét 1 ml 0,8 mól/literes NaCl-ben szuszpendáljuk. 0,1 ml-es alikvotokat terítünk szét Trypticase-Soy Agar (BBL) tápközeg felületére, amely tápközeget 10,8% szacharózzal dúsítottunk, hogy ozmotikusán stabilizáljuk a protoplasztokat. Miután a Pet-42 23
