202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
39 HU 202279 B 40 Az A'mal-el emésztett pIT221 DNS plazmidot újra feloldjuk 100 /ul 1 x ligáló pufferban, amely még 500 egység T4 DNS ligázt is tartalmaz. A ligálási reakciókeveréket 12 °C hómérsékleten inkubáljuk ~ 16 órán ót, majd E. coli K12 JA221 transzformálására használjuk fel, lényegében a 4D. példa eljárása szerint. Az ampicillin-rezisztens pPS19 plazmid transzformánsokat a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével azonosítjuk. A pPS19 plazmid DNS-t lényegében az 1. példa eljárásával összhangban állítjuk elő. A pPS19 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 6. ábra mutatja be. C. A pPS19 plazmid DNS BamHI-emésztése és Klenow-kezelése, valamint a ~ 7,7 kb-s fragmens izolálása 50 Mg pPS19 plazmid DNS-t emésztünk BamHl restrikciós enzimmel és kezelünk Klenow-fragmenssel, lényegében a 4A. példa eljárásával összhangban, de azzal a kivétellel, hogy Ncól restrikciós enzim helyett BaoMl restrikciós enzimet alkalmazunk. A őamHI-vel emésztett, Klenow-kezelt pPS19 plazmid DNS-t lX-os agaróz gélre terheljük, és a - 7,7 kb-s fragmenst izoláljuk és tisztítjuk, lényegében a 2B. példa eljárása szerint. Mintegy 5 Mg kívánt fragmenst nyerünk, amelyet feloldunk 10 m1 TE pufferben, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. D. A pPS21 plazmid végső megalkotása 2 m1, 5A. példa szerint készített ~ 0,85 kb-s fragmenst ligálunk 2 m1> 5C. példa szerint készített ~ 7,7 kb-s fragmenshez, 30 1 1 x ligáló pufferban, amely 500 egység T4 ligázt is tartalmaz. A ligálási reakciókeveréket 12 °C hőmérsékleten, 16 órán át ligáljuk, és a ligáit DNS alkotja a kívánt pPS21 plazmid DNS-t. E. Az E. coli K12 JA221/pPS21 megalkotása Az 5D. példa szerint készített, ligáit DNS-t használjuk fel E. coli K12 JA221 transzformálására, lényegében a 4D. példa szerinti eljárással összhangban. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat átvizsgáljuk pPS21 plazmid jelenlétére a transzformánsok plazmid DNS-ének restrikciós enzimes elemzésével. Mivel a ~ 0,85 kb-s fragmens egy vagy két orientációban iktatódhat be a pPS19 plazmid ~ 7,7 kb-s fragmensébe, és mivel csak az egyik orientáció helyezi el megfelelően a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját a higromicin-rezisztencia átadó-gén kifejeződéséhez, a transzformánsok nak csak mintegy fele a kívánt E. coli K12 JA221/pPS21. Egy ilyen E. coli K12 JA221/pPS21 transzformánst alkalmazunk a pPS211 DNS készítésére, lényegében az 1. példában leírt eljárással összhangban. 6. példa A Cephalosporium acremonium genetikai transzformációja a pPS20 és pPS21 plazmidokkal A 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás magában foglalja és igénypontokban megfogalmazza az itt következő transzformációs folyamatot. A. Cephalosporium acremonium törzsek A transzformáláshoz alkalmazott előnyös Cephalosporium törzset az American Type Culture Collection-tól (Rockville, Maryland) nyerjük, ahol az az ATCC 11550 letéti számon található. Egyéb Cephalosporium törzsek, vagy az ATCC 11550-ből cefalosporin C megnövelt termelése céljából mutációval, szelekcióval vagy genetikai nemesítéssel kialakított bármilyen kereskedelmi forgalomban levő törzs is alkalmasak transzformánsok előállítása céljából a jelen találmány szerinti vektorokkal és plazmidokkal. B. Inokulum készítése a sejt tenyésztéséhez Hogy genetikailag hatékonyan transzformáljuk a Cephalosporium acremonium sejteket, el kell távolítani a sejtfalakat, hogy stabil protoplasztokat képezzünk. Az ilyen protoplasztok készítésében nagyon előnyös egységes inokulummal kezdeni. Egyébként a sejtek előállítása tenyészetben nem reprodukálható, és nagy időveszteség kísérletezni C. acremonium protoplasztok előállításéval alkalmatlan vagy nem elegendő mennyiségű sejtekből. C. Egyforma inokulum készítése a sejttenyészetekhez Egy ampullányi spórát (mintegy 109 konidium 1,5 ml fenntartó közegben: 5% lak tóz, 10% glicerin, és 0,1% Tween 80), vagy liofilezett, vagy folyékony nitrogénes tárolóból kivett és szobahőmérsékleten felengedtetett mintát, 5 ml steril fiziológiás sóoldattal felhígítunk. Ebből a szuszpenzióból “mintegy 0,1 ml-t használunk mintegy 50 ferde agar tenyészet beoltásához, az egyes tenyészetek 20 ml Trypticase-Soy-Agar (BBLTM, Division of Becton, Dickinson and Company, Cockeysville, Maryland 21030) tápközeget tartalmaznak. Inokulálás előtt a tápközeget száradni hagyjuk, amig a felület nedt'essége már nem látható. Az inokulált lemezeket mintegy négy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22
