202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
19 HU 202279 B 20 mű amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás kitanitása szerint. A 4 492 758 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás mitokondriális DNS szegmenseket ir le, amelyeket be lehet iktatni valamely vektorba, pl. pPS20 plazmidba, hogy a vektor extrakromoszómális replikációhoz szükséges funkciókat szolgáltassa C. acremoniumban. Amint fentebb leírtuk, a pPS20, és a pIT335, amely egyike azoknak a plazmidoknak amely a pPS20 plazmidból származik, tartalmaznak egy Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát. Mivel a pIT335 és pPS20 plazmidokon elhelyezkedő C. ]f, acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát lehet alkalmazni DNS szekvenciák széles választéka kifejeződésének elősegítésére, az aktiváló szekvencia jelentős részét képezi a jelen találmánynak. Bár a C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciára vonatkozó szekvenciális adatok korlátozottak, az aktiváló szerkezetről tudjuk, hogy a pIT335 és pPS20 plazmidokon levő, izopenicillin N aktivitást kódoló DNS-tól közvetlenül .felfelé’ és azzal szomszédosán elhelyezkedő - 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmensen kódolódik. Bármilyen restrikciós fragmens, amely tartalmazza a fentebb említett - 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmenst, szükségszerűen tartalmazza a C. acre- 5 monium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát. A pIT335 plazmidon kódolt Cephalosporium acremonium átíró- és transzlációs aktiváló szekvenciára vonatkozó adatok az alábbiak. 10 Az alábbi szekvencia az a DNS szekvencia, amely .felfelé' van a pIT335 plazmidon jelen levő izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS-tól. Az - 500 bp-s SaR-Ncol restrikciós fragmens szekvenciájának, amely az aktiváló szekvenciát tartalmazza, csupán egy részlete ismert, amely ki is tűnik a szekvenciában ábrázolt .XXXXXXXXXX’ területből. Abból a célból, hogy tovább tisztázzuk, hogy az aktiváló szekvencia hogyan orientálódik a 20 pIT335 plazmidban, a restrikciós fragmenst csupán egyszálú DNS átfedésekkel ábrázoljuk, amely a SaR és Ncol restrikciós hasításokra jellemző. A Cephalosporium acremonium részleges 25 DNS szekvenciája. A pIT335 plazmidon kódolt átíró és transzlációs aktiváló szekvencia ^— 380 bp —>■ 5’-TCGAC XXXXXXXXXX CGAATACTTG AATATTCCTT GGJCGCTCTT iniímii imnim muiiiii iniiiiin 3’-G XXXXXXXXXX GCTTATGAAC TTATAAGGAA CCAGCGAGAA CTGATTTTCG AGGCTTCTCC TTCCGCCATC GTCGCCTCAC Mimii nimiiii Minim iiiiiiim GACTAAAAGC TCCGAAGAGG AAGGCGGTAG CAGCGGAGTG GCATATCTCG TCTTTCACAT CTTACACCAG CAGGACAAAC ii mi 1111 iiinmii fi it mi 1111! ii míi i CGTATAGAGC AGAAAGTGTA GAATGTGGTC GTCCTGTTTG CGTCAC-3’ min GCAGTGGTAC-5’ T az izopenicillin N-szintetáz kódoló terület kezdete. .TAC’ komplementer az 5’- r,o -ATG-3’-vel, amely az izopenicillin N-szintetáz amino-terminálisán levő metionil gyököt kódolja. A Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját lehet al- 55 kalmazni, hogy elősegítse bármilyen DNS szekvencia kifejeződését, amint ezt a pPS21 plazmid illusztrálja. A pPS21 plazmid a pIT221 plazmid származéka, amely úgy jön létre, hogy a higromicin rezisztencia átadó p,o gén kifejeződésének elősegítésére alkalmazott PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát helyettesítjük a jelen találmány szerinti Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciával. A helyettesítést 55 12 úgy hajtjuk végre, hogy először eltávolítjuk a pIT221 plazmid ~ 300 pb-s A'mal fragmensét, a pPS19 plazmidot képezve. Ezt a Amal deléciót azért hajtjuk végre, hogy eltávolitsunk egy BamHl restrikciós enzim felismerő helyet, amely zavaróan hatna a pPS21 megalkotására. A pPS19 plazmidot azután BamHI-vel emésztjük és E. coli DNS polímeráz I Klenow-fragmenssel kezeljük. A BamHI emésztés kimetsz egy ~ 230 bp-s BamHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza a PGK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát; a Klenow-kezelés kétszálúvá teszi a DNS-t az egyszálú BamHI átfedéseken kívül. A pPS19 plazmid nagy, - 7,7 kb-s BamHI fragmensét azután ligáljuk a pIT335 plazmid ~ 0,8 kb-s, Klenow-kezelt, Nco1 restrikciós fragmenséhez, amely
