202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
21 HU 202279 B 22 tartalmazza a C. acreraonium étiró és transzlációs aktiváló szekvenciáját. Természetes, hogy a Klenow-kezelt Ncól restrikciós fragmens a két orientáció bármelyikébe iktatódik be, amelyek közül csupán az egyik éri el a kivánt eredményt - a Cephalosporium acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia korrekt elhelyezkedése olyan, amely elósegiti a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS21 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 7. ábra adja meg, és a pPS19 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 6. ábra adja meg. A pPS21 plazmid megalkotásának részletesebb leírását az 5. példában adjuk meg. A pPS2lA egy másik, találmány szerinti vektor, amely hasznosítja az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia-átadó gén kifejeződését Cephalosporium acremoniumban. Egy hasznos köztes plazmidot, amelyet pPS23 plazmidnak jelölünk, alkalmazunk a pPS21A plazmid megalkotásában. A pPS23 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy izoláljuk a pIT335 plazmid - 850 bp-s Ncol restrikciós fragmensét, amely az IPS gén aktiváló szekvenciáját tartalmazza, hozzátapasztunk BamHI-el és Wcol-el összeférhető, egyszálú átfedésekkel rendelkező kapcsolókat (linkereket) a - 850 bp-s Ncól fragmenshez, és az így létrejött pIT335 plazmid-eredetű, ~ 860 bp-s BamHl restrikciós fragmenst ligáljuk BamHI-vel emésztett pUC8 plazmidhoz. Ez a ligálás két plazmidot eredményez, amelyet pPS23-nak, illetve pPS23.1-nek nevezünk, amelyek csupán a beiktatott őamHI restrikciós fragmens orientációja tekintetében különbőznek egymástól. A pUC8 plazmid a Pharmacia P-L Biochemicals-nál (BOO Centennial Ave., Piscataway, New Jersey, 08854, Amerikai Egyesült Államok) rendelkezésére áll. A pPS23 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, és a ~ 860 bp-s BaoiHI restrikciós fragmenst, amely tartalmazza az IPS átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, izoláljuk és ligáljuk BamHI-el emésztett pPS19 plazmiddal. Ez a ligálás egy sor hasznos plazmidot alakit ki, beleértve a pPS21A plazmidot. A pPS21A a pPS23 plazmid - 0,86 kb-s BamHI restrikciós fragmensének a pPS19 plazmid ~ 7,7 kb-s BamHI restrikciós fragmenséhez való ligálásának eredménye, és tartalmazza a megfelelő orientációban elhelyezve az IPS gén átíró és transzlációs aktiváló szekvenciáját, amely elősegíti a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS23 plazmid megalkotásában alkalmazott linkerek biztosítják, hogy a megfelelő leolvasó keret maradjon fenn a pPS21A plazmidban a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződéséhez. A pPS21A plazmid megalkotását a 7. példa Írja le; a pPS21A plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 8. ábrában adjuk meg. Számos más hasznos plazmidot is alkotunk ugyanazzal a ligálással, amely a pPS21A plazmidot alakította ki. A pPS22 plazmid ugyanazokat a szekvenciákat tartalmazza, mint a pPS21A plazmid, de a Bamtil restrikciós fragmens, amely az IPS gén aktiváló szekvenciáját tartalmazza, ellenkező irányú orientációban van, mint a pPS21A plazmidban. Következésképpen a pPS22 plazmid nem ad át higromicin rezisztenciát Cephalosporium acremoniumnak nagy gyakorisággal, így a pPS22 plazmid használható negativ kontrollként szolgál a C. acremonium transzformációkban. Ebben a ligálásban termelt másik plazmid hasznosítást nyerhet mind negatív kontrollként Cephalosporium acremonium transzformációkban, mind olyan plazmidként, amelyet olyan C. acremonium szekvenciák azonosítására lehet használni, amelyek rendelkeznek átíró és transzlációs aktiváló aktivitással. Amint fentebb leírtuk, a pPS19 plazmid tartalmazza a Saccharomyces cerevisiae Í*GK átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát a megfelelő orientációban, hogy elősegítse a higromicin rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS19 plazmid emésztése BamHl restrikciós enzimmel két fragmenst termel; az egyik fragmens mintegy 230 bp méretű és tartalmazza a PGK aktiváló szekvenciát, és a másik fragmens - 7,6 kb méretű, és tartalmazza a higromicin rezisztencia átadó génhez szolgáló kódoló szekvencia legnagyobb részét. A pPS19 plazmid - 7,6 kb-s BamHl restrikciós fragmensének kör alakúvá tételével a pPS24 plazmid keletkezik, amely nélkülöz egy átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amely úgy helyezkedik el, hogy elősegítse a vektoron jelen levő higromicin-rezisztencia átadó gén kifejeződését. A pPS24 plazmid ezért transzformálhatja a Cephalosporium acremoniumot higromicin rezisztenciára, integrálva C. acremonium DNS-be olyan helyzetben, hogy egy endogen C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvencia hajtja a gén kifejeződését. Következésképpen a pPS24 plazmid DNS integrálódása helyének azonosítása egy higromicinre rezisztens C. acremonium/pPS24 transzformánsban azonosit egy C. acremonium átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát is. Egy más módszer szerint C. acremonium DNS-t klónozni lehet pPS24 plazmid egyedi BanMl helyébe, és az igy létrejött plazmidot alkalmazni C. acremonium transzformálására. Azok a plazmidok, amelyek transzformálják C. acremoniumot higromicin rezisztenciára nagy gyakorisággal, szükségszerűen magukban foglalnak egy átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát, amely működőképes C. acremoniumban. Még további hasznos plazmidokat is állítunk elő ugyanazzal a ligálással, amellyel a pPS21A plazmidot előlállitjuk. Ezeket a plazmidokat, amelyeket pPS25 és pPS25.1-nek jelölünk, a pPS19 plazmid két BamHI 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 r>5 13
