202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
1 2 HU 202279 ß A jelen találmány tárgya izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorok és gazdasejtek előállítása. Az izopenicillin N-szintetáz katalizálja azt a reakciót, amelyben az izopenicillin N képzó- 5 dik é-(L-c£-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból. Ez a reakció kritikus lépés fontos antibiotikumok bioszintézisében, pl. a penicillinekében Penicillium chrysogenumból, Cephalosporium acremoniumból, és Sreptomyce6 cla- 10 vuligerusból, vagy pl. a cefalosporinokéban C. acremoniumból, vagy a 7-ot-raetoxi-cefalosporinokéban S. clavuligerusból. Az új DNS szekvenciát, amely az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódolja, Cepha- 15 losporium acremoniumból izoláljuk és rekombináns DNS kifejeződő vektorok megalkotásához használjuk, amelyek előreviszik az aktivitás kifejeződését. Ezeknek a kifejeződő vektoroknak két tipusa különösen hasznos. A 20 vektorok első tipusa az izopenicillin N-szintetáz magas szintű kifejeződését E. Coli-ban hajtja előre, a másik típus viszont a Cephalosporium acremoniumban viszi előre az aktivitás kifejeződését. 25 Az E. coli által termelt izopenicillin N-szintetáz aktivitást in vitro vizsgálatokban mutatjuk ki, izopenicillin N-t képezve é-(L-oí-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból. A jelen találmány szerinti E. coli vektorokkal 30 transzformált E. coliból származó nyers sejt-extraktumok izopenicillin N-szintetáz aktivitást mutatnak bármiféle előzetes aktiváló kezelés nélkül. A jelen találmány szerinti E. coli vektorok igy hatásos eszközt nyújtanak 35 nagy mennyiségű aktiv izopenicillin szintetáz nyerésére. Az izopenicillin N szintetáz nem csupán az izopenicillin N termeléséhez hasznos, hanem a 6-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valintól eltérő tripeptidek kondenzáló- 40 sához is, ilyen módon új antibiotikumokat képezve. A jelen találmány szerinti Cephalosporium vektorok törzsjavitás céljaira hasznosak. A Cephalosporium gazdaságilag fontos orga- 45 nizmus, amely penicillin és cefalosporin antibiotikumok termelésében használatos. A Cephalosporium transzformálása bizonyos, jelen találmány szerinti rekombináns DNS kifejeződő vektorokkal nagyobb in vivo izopeni- 50 cillin N-szintetáz szintet eredményez a transzformánsokban, igy megnövekedett hatékonyság és magasabb kitermelés mutatkozik ezeknek a transzformánsoknak az alkalmazásával végzett fermentációknál. 55 Az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-vegyületeket könnyen lehet módosítani, olyan kifejeződő vektorokat alkotva meg, amelyek növelik más organizmusokkal, pl. Penicillium chrysogenummal és Streptomyces 60 clavuligerussal végzett fermentációk hatékonyságát és kitermelését. Bár a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-t Cephalosporium acremoniumból izoláltuk, a jelen DNS-vegyületeket lehet hasz- 65 nálni olyan vektorok megalkotására, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződését gazdasejtek széles választékéban viszik előre, ilyenek pl. a jelen találmányban Í6 bemutatott E. coli vektorok. Minden organizmus, amely termel penicillint és cefalosporint, a közös 4-(L-c£-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin és izopenicillin N prekurzorokat alkalmazza. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagot lehet alkalmazni olyan vektorok előállítására, amelyek bármely nemzetséghez tartozó penicillin- és cefalosporin antibiotikum-termelő organizmust érintő fermentáció hatékonyságának és kitermelésének javításához használhatók. A jelen találmány szerinti DNS-anyagok Cephalosporium acremonium genom DNS-éból származnak, és jelentős homológiát mutatnak a Streptomyces clavuligerusban, Penicillium chrysogenumban és más, izopenicillin N-szintetázt termelő organizmusokban levő izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagok nukleotid-szekvenciájához. E miatt a homológia miatt a jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-anyagokat jelezni lehet és az olyan organizmusok genom könyvtárának átvizsgálására alkalmazni, amelyek izopenicillin N-t vagy hasonló vegyületeket alakítanak ki izopenicillin N-szintetáz típusú enzimek jelenlétében. Több organizmus tartalmaz olyan DNS-t, amely olyan izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódol, amely a jelen találmány szerinti DNS anyag által kódolt aktivitással lényegében egyenértékű, és a jelen találmány magában foglalja ezeket az ekvivalens DNS anyagokat is. A jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS anyagok Cephalosporium acremonium genom DNS-böl származnak, és az átíró és transzlációs aktiváló szekvenciával egyesülve vannak izolálva, amely szekvenciák a C. acremonium izopenicillin N-szintetázt kódoló genom DNS kifejeződését szabályozzák. A jelen találmány magában foglalja azt az új átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát is, amelyet, amint ezt itt ismertetjük, heterológ gének kifejeződésének végrehajtásához alkalmazunk C. acremoniumban. A következő részben a jelen találmány részletesebb leírását nyújtjuk. A jelen találmány világosabb megértése céljából a következő kifejezéseket határozzuk meg, amelyeket ez után a leírásban és igénypontokban gyakran használunk.- Antibiotikum - mikroorganizmus által termelt anyag, amely, vagy természetes formájában, vagy bizonyos kémiai módosítások után, gátolja más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését, vagy elpusztítja azokat.- Antibiotikum bioszintetikus gén - DNS-szegmens, amely olyan enzimes aktivitást kódol, amely valamely enzimes reakcióhoz 3
