202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
17 HU 202278 b 18 A peptideket Waters nagynyomású folyadékkromatografáló rendszerrel frakcionáltuk, Altex Ultrasphere Octyl oszlop alkalmazásával. Az elúciót trifluorecetsav/viz -trifluorecetsav/acetonitril lineáris elúciós grádiens alkalmazásával végeztük. A peptideket az aminosavak analízisével azonosítottuk. Az 1. táblázatban adjuk meg az emberi eredetű rekombináns gamma-interferon (r-HuIFN-gamma) rövidített formáira f, vonatkozó adatokat. L táblázat r-HulFN-gamma C-láncvég** Fajlagos aktivitás, % formája* 139aa/143aa arány: 98:2 LFRGR 100 (összehasonlításul) 131aa AAKTGKRKR 40-50 129aa AAKTGKR 6-9 12Saa AAK körülbelül 1 * Az 1. ábrán bemutatott számozási rendszer alapján, figyelmen kívül hagyva azonban az N-terminális metionint, amely mindegyik esetben szintén jelen van. ** Az aminosav-maradékokra vonatkozó szokásos egybetűs rövidítések: A = alanin F = fenilalanin G = glicin K = lizin L = leucin R = arginin T = treonin Feltételezésünk szerint a 126aa-143aa közötti bármilyen hosszúságú gamma-interferonok (nem számítva az N-terminális metionint) megfelelően kialakított génekből képződnek. Így például az 1. ábrán vázolt gén egy Fnu4H restrikciós helyet tartalmaz: 123 124 Ala Alá GCk GCT CGTI CGA Az Fnu4H-val végzett restrikció után a szintetikus oligonukleotidokat, amelyek bármilyen kívánt szekvenciát kódolnak, ahol egy .megállító' kodon és az expressziós plazmidban rendelkezésre álló restrikciós hellyel összeférhető összekapcsoló helyezkedik el utána, hozzákapcsolhatjuk a gamma-interferon génjének elejéhez. Például az alábbi szekvenciát A GCT AAA ACA TA-(X)CGA TTT TGT ATCTAG ahol X egy vagy több aminosavat kódol, hozzákapcsolhatjuk a fentebb példaképpen leirt Escherichia coli expressziós vektorhoz miután feltártuk a plazmidol Fnu4H és Bglll segítségével. így az alábbi megállító kodon jött létre: stop ...(x)-taIgatc... atctagI Bglll E. A citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata 1. A vizsgálat leírása 35 A lemezek mindegyik bemélyedésébe bemérünk 100 mikroliter mennyiségű emberi tüdőkarcinoma (A549) sejt (ATCC száma CCL 185) szuszpenziót, amely milliliterenként 40 4xl05 sejtet tartalmaz Eagles MEM közegben. A lemezeket mintegy 18 órán át inkubáljuk 37 °C-on. 18-24 órás inkubálás után az első oszlopban lévő valamennyi bemélyedésbe bemérünk 80 mikroliter további táptalajt. 45 Az első oszlop egyik bemélyedésébe 20 mikroliter mennyiségű mintát mérünk be, amelynek az interferon-aktivitását meg kívánjuk határozni. Ezután az első oszlopban lévő minden 50 egyes bemélyedés tartalmából 100 mikroliter mennyiséget átviszünk a második oszlopban lévő szomszédos bemélyedésbe. Ezt az eljárást tovább folytatjuk, azaz mindig egy következő oszlopba átviszünk az egyes bemé- 55 lyedésekból 100 mikroliter mennyiséget mindaddig, amíg a 11. oszlopot el nem érjük (öszszesen 10 átvitel). 24 órás inkubálás után a kontroll sejtet tartalmazó bemélyedések kivételével mind- 60 egyikbe bemérünk 50 mikroliter enkefalomiokarditisz vírust. Ez a fertőzés 100X-os citopatikus hatást eredményez 24 órával a megfertőzés után. A lemezeket lefedjük és 24 órán át in- 05 kubálunk 37 UC hőmérsékleten. Az összes beli
