202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
19 HU 202278 B 20 mélyedésből kiöntjük a folyadékot és 5-15 perc alatt megfestjük 0,5%-os kristályibolya-oldattal. A sejtek életképességét a megfestett sejtek megfigyelésével határozzuk meg. Valamely minta titere annak a higitásnak a reciproka, ahol a sejtek 50%-a életképes marad. 2. Az eredmény kiszámítása Valamennyi minta aktivitásának normalizálására egy faktort alkalmazunk) amelyet úgy kapunk, hogy a standard interferon tényleges titerét elosztjuk a mért titerrel. 3. Fajlagos aktivitás A National Institute of Health (N1H) által rendelkezésre bocsájtott vonatkoztatási gamma-interferonnal normalizált A549/EMCV biológiai vizsgáló rendszer alkalmazásával azt az eredményt kaptuk, hogy az emberi eredetű rekombináns gamma-interferon fajlagos vírusellenes aktivitása mintegy háromszorosa a módosított rekombináns gamma-interferonénak, amelynek molekulásja három további aminosavat tartalmaz az N-végcsoportnál (cys-tyr-cys-). 4. Stabilitás Ismét a fenti biológiai aktivitásmérés alapján azt tapasztaltuk, hogy a gyógyászati készítménnyé alakított és lezárt rekombináns gamma-interferon az előállításától számított három hónapig stabil marad 4 °C-on történő tárolás esetén (a biológiai aktivitása nem csökken). F. A rekombináns gamma-interferon sejtburjánzás elleni hatása, összehasonlítva az emberi eredetű interferon más típusaival 1. Anyagok és módszerek Rekombináns gamma-interferon: Cys-Tyr-Cys szekvencia nélküli rekombináns gamma-interferon oldat alakjában (20 mM nátrium-szukcinát, 0,15 M nátrium-klorid, pH=6). Az anyagot az Escherichia coli törzset alkalmazó fenti példa szerint állítottuk elő. A fajlagos aktivitás 2,7xl07 NE/mg fehérje volt. CTC-rekombináns gamma-interferon: A molekula N-végcsoportjánál a CYS-TVR-CYS- szerkezetet tartalmazó rekombináns gamma-interferon oldat alakjában (20 mM nátrium-szukcinát, 0,15 M nátrium-klorid, pH=6). A fajlagos aktivitás l,3xl07 NE/mg fehérje volt. Emberi eredetű béta-interferon: Emberi diploid elöbör fibroblasztból előállított liofilizált emberi fibroblaszt interferon, amelynek a fajlagos aktivitása több mint lxlO7 NE/mg fehérje (gyártotta: Toray Ind., Inc.). Egy ampulla 3xl06 NE emberi eredetű béta-interferont és 3 mg emberi szérum albumint tartalmaz. Emberi eredetű alfa-interferon: Emberi eredetű természetes leukocita interferon, a fajlagos aktivitása 4x10s NE/mg fehérje. Oldatban szállítja a Dr. K. Cantell, Central Public Health Laboratory, Helsinki. Kontroll: 3 mg emberi szérum albumint tartalmazó placebo. Táptalaj: Eagle minimális esszenciális táptalajt, amelyet 10% mennyiségű, hővel inaktivált prekolosztrum újszülött borjú szérummal és 2 mM L-glutaminnal egészítettünk ki, használtunk a Hela, KB, HMV-1, FL és J-lll sejtekhez. Az A549 sejtekhez Dulbecco minimális esszenciális táptalajt használtunk, amely 10% mennyiségű, hővel inaktivált prekolosztrura újszülött borjú szérumot, 100 pg/ml kanamicint és 2 mM L-glutamint tartalmazott. A 2. táblázatban felsorolt többi sejthez RPMI 1640 táptalajt használtunk, amelyet hővel inaktivált prekolosztrum újszülött borjú szérummal és 100 pg/ml kanamicinnel egészítettük ki. 2. A sejtburjánzás elleni hatás kiértékelése A vizsgálatokhoz használt, táptalajban szuszpendált sejteket műanyagból készült szövettenyészet lemezekre vittük át bemélyedésenként 5xl03 sejt/0,5 ml mennyiségben. 0,5 ml megfelelő táptalajban oldott, különböző mennyiségű interferont adtunk ezután hozzá (0. nap). A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végeztük, 5% szén-dioxidból és 95% levegőből álló, nedvesített atmoszférában. A 6. napon a táptalajokat eltávolitottuk, és a szuszpenziós tenyészetben lévő sejteket közvetlenül Isoton Il-ben (Coulter Electronics Inc.) szuszpendáltuk Coulter-számlálóban történő sejtszámláláshoz. A lapot képező sejteket műanyag edényekben előkezeltük 0,05% tripszinnel és 0,02% etilén-diamin-tetraecetsavval, hogy egyedülálló sejteket tartalmazó szuszpenzióhoz jussunk Isoton II-ben. Az interferon sejtburjánzás elleni hatását a sejtszám 50%-os csökkentéséhez szükséges vírusellenes egységekben (ICso, NE/ml) fejezzük ki, az interferont nem tartalmazó kontroll tenyészethez viszonyítva. Amint a 2. táblázatban látható, a rekombináns gamma-interferon sejtburjánzás elleni hatása jelentős mértékben eltérő volt a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 G5
