202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

15

HU 202278 B

16

Mennyiség ampullánként, mg

Komponens 0,5 mg-os ampulla* 2,0 mg-os ampulla“

emberi eredetű rekombináns gamma-interferon

0,5

2,0

mannit

100

80

borostyénkósav-dinátriumsó-hexahidrét

12,4

9,9

glicin

5,6

4,5

nátrium-klorid

4,4

3,5

poliszorbát 20

0,8

0,6

borostyánkősav

0,5

0,4

* Befecskendezéshez az ampulla tartalmát 2,5 ml steril vízben oldjuk. “ Befecskendezéshez az ampulla tartalmát 2,0 ml steril vízben oldjuk.

A találmány szerinti interferonokat gyógyászatiig megfelelő dózisban alkalmazhatjuk, például 1,0 mg/m* testfelület dózisban.

20

D. Különféle gamma-interferonok aktivitásának meghatározása tripszinnel történő feltárás után

25

A karboxil-végcsoportú aminosavakban eltérő különböző gamma-interferonok aktivitásénak meghatározáséra, a fenti, Escherichia coli törzs alkalmazásával kapcsolatos példában leírt módon előállított gamma-interferont 30 tripszinnel különböző mértékben emésztettük, majd felhasználtuk a citopatikus hatás gátlására A549 sejtek alkalmazásával, a későbbiek során leirt módon.

6,5 mg mennyiségű, a fentiek szerint 35 előállított rekombináns gamma-interferon (r-HuIFN-gamma) mintát sótalanítottunk kis méretű, Sephadex G-25 molekulaszitát tartalmazó oszlopon (PD-10, Pharmacia), és az interferont 0,10 M ammónium-hidrogén-karbo- 40 nát pufferoldatba (pH=8,5) vittük át 2,1 mg/ml végső fehérjekoncentrációig. A kapott interferon-oldat 1,9 ml (4,0 mg interferon-tartalom) mennyiségéhez 16 jul mennyiségű híg tripszin-oldatot (Worthington TPCK tripszin, 45 10 ug/ml koncentráció 0,001 M sósav-oldatban) adtunk, összekevertük és szobahőmérsékleten inkubáltuk (a tripszin és a fehérje aránya 1:25000). Az inkubélt elegyból mintát vettünk 1 óra, 3,5 óra, 5,75 óra, 8 óra és f,o 10,25 óra elteltével. 8 óra múlva további 15 /ul (150 ng) híg tripszin-oldatot adtunk hozzá, hogy meggyorsítsuk a reakciót a 10,25 óra elteltével vett utolsó minta számára.

Az egyes időpontokban vett mintákat a 55 komponensek meghatározására frakcionálásnak vetettük alá Waters nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszerben, BioRad Biogel HPHT oszlop alkalmazásával. Az ammónium-hidrogén-karbonát pufferoldatban lévő fio mintát kézi befecskendezéssel közvetlenül az oszlopba vittük be a mintavétel időpontjában. Hagytuk, hogy az oszlopban egyensúly alakuljon ki 0,01 M nátrium-foszfát-oldattal (pll=8,0), amely 30 pM kalcium-kloridot tártál- 65

mázott, majd a fehérjét az egyensúly kialakításához használt pufferoldattal (lineáris gradiens mellett) és 0,5 M nátrium-foszfát pufferoldaLtal (pH=8,0, 0,6 pM kalcium-klorid)

eluáltuk.

A 214 nm-nél és 280 nm-nél jelentkező abszorbancia alapján határoztuk meg a fehérjéhez tartozó maximumokat. A megfelelő frakciókat összegyűjtöttük és az analízis elvégzéséig 4 °C-on lefedve tároltuk. A kiválasztott maximumokhoz tartozó frakciókat az alábbi vizsgálatoknak vetettük alá:

1. Vírusellenes hatás meghatározása emberi tüdőkarcinoma A549/EMC vírussal szemben [Stewart, Interferon Systems, Ed.: Stewart, 13. oldal, Springer Verlag, New York, 1979].

2. Frakcionálás nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel a Laemmli gélrendszer alkalmazáséval (Laemmli, Nature,

227, 680 (1970)].

3. Fehérjekoncentráció meghatározása az ipari festékmegkötó eljárással (Pierce Chemical Co., Rockford, 11.).

4. Fehérjehasitás cianogénbromiddal, majd nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis a peptidek azonosításához [Gross és munkatársai, Methods in Enzymology, A7, 238].

A fehérjemintákat egy éjszakán át dializáltuk (12000-14000 mw megszakítás) 70X-os hangyasavval szemben, forgóbepárlóban szárazra pároltuk és ismét felszuszpendáltuk 500 pl 70%-os hangyasavban. Szilárd cianogénbromidot adtunk minden egyes mintához 12x75 mm méretű üvegcsőben, a csöveket leforrasztottuk, a szilárd anyag oldódáséig ráztuk, alumíniumfóliával beborítottuk és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten, jó szellőztetés közben.

Amikor a cianogénbromidos hasítás befejeződött, a mintákat forgóbepárlón szárazra pároltuk, a maradékot 0,5 ml vízben szuszpendáltuk és szárítottuk. Nagynyomású folyadékkromatográffal történő frakcionálás előtt a mintákat 50%-os hangyasavban oldottuk, s annyi hangyasavat alkalmaztunk, hogy a fehérjekoncentráció körülbelül 1 mg/ml legyen.

10