202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 202278 B 8 nak, azaz amelyek mintegy 129-143 aminosavból állnak. Tekintettel a fentiekre, nyilvánvaló, hogy a találmány nem csupán azokra a rekonibináns gamma-interferonokra terjed ki, amelyek a fentebb vázolt teljes szekvenciával rendelkeznek, hanem azokra az anyagokra és keverékeikre, amelyekből hiányzik a 143. aminosav vagy a Z aminosavszekvencia és a 143. aminosav közötti rész, ahol Z jelentése 127., 128., 129., 130., 131., 132., 133., 134., 135., 136., 137., 138., 139. 140., 141. vagy 142. számú aminosav. Hasonló módon nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat kódoló kétszálas DNS-szekvenciák nem csupán azokat foglalják magukba, amelyek a fenti teljes szekvenciát kódolják, hanem azokat is, amelyek a különböző elhasított, fentebb leírt analógokat kódolják. .Rekombináns gamma-interferon‘-on rekombináns DNS-technológiával kialakított replikálható expressziós vektor által egy transzformáns sejtben kifejezett (és a transzformáns sejt által akár glikozilezett, akár nem glikozilezett) polipeptidet értünk, amely kisebb vagy nagyobb mértékben rendelkezik vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes hatással emberen, továbbá érzékeny pH=2 értékű savas közeg behatására, hasonlóan a természetben megtalálható (natív), emberi eredetű (humán) gamma-interferonhoz. A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat úgy tekintjük, hogy dimereket képeznek két polipeptidből, amelyek mindegyike tartalmazza legalább az 1-től 126- -ig terjedő aminosavakat (e polipeptidek azonos vagy eltérő számú aminosavból állhatnak). Nem ismerjük pontosan azt a kémiai mechanizmust, amellyel a két polipeptidből a dimer kialakul, feltételezzük azonban, hogy másról van szó, mint kovalens kötésről. Ügy tűnik, hogy a dimerek spontán módon jönnek létre, és elkerülhetetleneknek látszanak az itt leirt rendszerek esetén. Ennek következtében, ha a találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat gyógyításra felhasználjuk, azok rendszerint dimerizált alakban lesznek jelen. Továbbá magától értetődik, hogy hasonló módon a különbözőképpen jellemzett rekombinóns gamma-interferonokkal foglalkozó szakirodalmi publikciókhoz [Derynck, R. és munkatársai, Interferon Scientific Memoranda, August 1982, Memo-I-Al 193/2; Derynck, R. és munkatársai, .Expression of Human Interferon Gamma in Heterologous Systems’, Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, Inc., 1983, 247. oldal], az interferon aktivitásának megszűnése nélkül lehetőség van aminosavak kicserélésére vagy hozzáadására, különösen egyetlen aminosav kicserélésére vagy hozzáadására avagy aminosavak csoportjainak kicserélésére a 126. számú aminosav előtt vagy után. Ügy véljük, 6 hogy a szakember számára nem jelent nehézséget az aminosavak kicserélésének vagy hozzáadásának végrehajtása, és ennek során nem távolodik el a találmány oltalmi körétől. A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonok a teljes szekvencia (lásd az 1. ábrát) módosításait és alléi változatait tartalmazó anyagokat is magukba foglalják, amelyek biológiai hatása egyenértékű vagy nagyobb, mint a teljes szekvenciát tartalmazó anyagé. Jellemző módon a tisztított rekombináns gamma-inLerferonok gyakorlatilag mentesek más, emberi eredetű fehérjétől, és így megkülönböztethetők a mindeddig rendelkezésre álló, természetes, emberi eredetű gamma-interferon készítményektől. A találmány olyan gyógyászati készítményekre is kiterjed, amelyekben a rekombináns gamma-interferon tisztasága - a készítménybe való bevitel előtt - nagyobb mint 95%, előnyösen nagyobb, mint 98%. így ezek a gyógyászati készítmények szintén megkülönböztethetők a natív gamma-interferonokat tartalmazó készítményektől, amelyek eddig hozzáférhetők voltak. Azok a találmány szerinti termékek, amelyeknél az N-terminális aminosavmaradék metionilcsoport, szintén megkülönböztethetők az emberi testben képződő gamma-interferonoktól, és a CYS-TYR-CYS- szekvencia hiányán kívül ebben is eltérnek azoktól az interferonoktól, amelyek szekvenciáját Gray és munkatársai ismertették iNature, 295, 503-508 (1982)]. A leírásban szereplő reprodukálható expressziós vektorok kétszálas DNS-ból, előnyösen olyan plazmidokból állnak, amelyek a következő részeket tartalmazzák; replikációs origó, promoter vagy promoter-operator, egy, a riboszóma megkötésének helyét kódoló szekvencia, a transzlációs startjelre vonatkozó kodon és azzal megfelelő leolvasó fázisban egy gén, amely a kérdéses rekombináns gamma-interferont kódolja, majd a transzláció megállítására vonatkozó kodon(ok). A szakember jól ismeri a DNS-rekombináció általános módszereit és szakkifejezéseit, utalunk azonban D. Goeddel és munkatársai 0077670 sz. publikált európai szabadalmi bejelentésére a gyakorlati ismeretekkel kapcsolatosan. A találmányt az alábbi példa segítségével részletesen ismertetjük. Példa A. Klónozás Gray és munkatársai fentebb idézett publikációjában leírt módon állítottunk elő gamma-interferon komplementer DNS szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS kiónokat indukált emberi eredetű perifériás vér 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
