202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 202278 D 10 limfocitákból információt hordozó ribonukleinsavval (mRNS). A p67 klón DNS-szekvenciájét az 1. ábrán mutatjuk be. Az 5’ nem transzlálódó szakasz után 23 aminosavból álló prekurzor- vagy jelpeptidet kódoló 69 nukleotid következik, majd 143 aminosavból álló érett interferon polipeptidet kódoló 429 nukleotid és a 3' nem transzlálódó szekvenciájú 587 nukleotid következik. B. Kifejezés 1. Escherichia coli alkalmazása Ahhoz, hogy az Escherichia coli törzs jelentős mennyiségű rekombináns gamma-interferont termeljen, a fehérjeszintézisnek az érett polipeptid glutamin kodonját (1. aminosavját) közvetlenül megelőző ATG kodonnál kell beindulnia, és nem a jelpeptidben lévő ATG-nél (SI aminosav) (1. ábra). A 2. ábrán mutatjuk be vázlatosan azt az eljárást, amellyel közvetlenül a p67 cDNS inszertumot (betoldást) termeltük Escherichia coli törzsben. Hasonló módon jártunk el, mint Gray és munkatársai a cDNS inszertum Escherichia coli törzsben történő termelésénél, lásd a fentebb idézett közleményüket. A jelpeptidet kódoló tartomány eltávolításához egy Avail restrikciós helyet használtunk, amely a feltételezett érett kódoló szekvencia 2. kodonjánál helyezkedett el. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot terveztünk, amelyek helyreállítják az 1. és 2. aminosavra vonatkozó kodonokat, magukba foglalnak egy ATG transzlációkiváltó kodont és létrehoznak egy XBal kohéziós végződést. Ezt a két oligomert hozzákapcsoltuk a cDNS inszertum fennmaradó részéhez, és így egy 1063 bázispárból álló szintetikus-természetes hibrid gént hoztunk létre, amely egy 144 aminosavból álló polipeptidet kódol és XBal és PstI helyekhez kapcsolódik. Ezt a gént beillesztettük a pLelF A25 plazmidba [Goeddel, D. és munkatársai, Nature, 287, 411-416 (1980)], az XBal és PstI restrikciós helyek közé, s ezáltal megkaptuk a pgaua-CYC5 termelő plazmidot. Az Escherichia coli W3110 törzset (F-, lambda-, protrof) (ATCC 27325) transzformáltuk ezzel a plazmiddal, és így az Escherichia coli W3110/pgM»«-CYC5 gazdasejt-vektor kombinációhoz jutottunk. 2. Sejttenyészet alkalmazása Mind a jelpeptidet, mind pedig a gamma-interferont kódoló gént, amint az az 1. ábrán látható, COS-7 sejtekben fejeztük ki (Gluzman, Cell, 23, 175 (1981)) radioaktiv izotóppal jelzett cisztein vagy metionin jelenlétében. Megállapítottuk, hogy a génből olyan érett gamma-interferon képződik, amelynek az N-terminális aminosavjai az 1. ábrán láthatók. (Eltérően attól az esettől, amikor az interferon termelését Escherichia coli törzsben végezzük, az emlősöktől származó sejtrendszerekben, például a fenti sejtekben képződő gamma-interferonból hiányzik az N- terminális metionin.) 60 mm átmérőjű Petri-csészékben lévő COS-7 sejtek összefolyó monomolekuláris rétegeit átfertóztük DNS-sel a módosított DEAE-dextrán eljárás alkalmazásával. Három nappal a DNS hozzáadása után eltávolitottuk a táptalajokat. Mindegyik lemezsorozathoz 100 uCi S35-metioninnal vagy S^ciszteinnel kiegészített 2 ml DMEM-t adtunk. A táptalajokat 16 órán át inkubáltuk a radioaktív izotóppal jelzett aminosav jelenlétében, majd 500 ul mennyiségükből immunkicsapást végeztünk első antitestként anti-gamma-interferon monoklonális antitest vagy anti-HBsAg monoklonális antitest, második antitestként pedig nyúl anti-egér IgG antitest (Cappell Inc.) alkalmazáséval. Az antitesttel való reakciót, majd utána Staphylococcus A sejtekhez (Calbiochem) történő kapcsolást Berman, P. és munkatársai ismertetik [Science, 222, 524 (1983)]. A mintákat újból szuszpendéltuk nátrium-dodecil-szulfát-merkaptoetanolban, és elektroforézisnek vetettük őket alá 1034 nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid géleken. A gélt etanolos 7% ecetsavval kezeltük, Enhance (New England Nuclear) fluor-oldattal átitattuk, szárítottuk, majd a kibocsájtott sugárzással két hétig világítottunk meg egy Kodak AR5 filmet, erősítő szűrő (Dupont) alkalmazáséval. Vizsgálataink során a következő plazmidokat használtuk: pSVgamma69 [0077670 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés]; pDL Rí [Simonsen és munkatársai, Mol. Cell. Bioi., 3, 2250 (1983)] ez egy hepatitisz B virus felületi antigén termelő vektor, amelyen a pSV- gamma69 alapul; és pDL Rigámmá Sau, ez policisztron plazmid, amely a pSVgamma69 plazmid 830 bázispárból álló SAU3a töredékét tartalmazza, és átfogja a pDL Rí plazmid EcoRI helyére illesztett, az egész gamma-interferont kódoló szekvenciákat. Ez utóbbi plazmid átírást hoz létre, amely mind a gamma-interferont, mind pedig a HBsAg-t kódoló tartományokat tartalmazza. Az S35-ciszteinnel és S35-metioninnal jelzett fehérjék - amelyek vagy anti-gamraa-interferonnal (A) vagy anti-HBsAg (B) anti-5 10 15 20 25 30 35 •10 45 50 55 60 7
