202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 202278 B G tése MET-, Y jelentése GLN-. Az N-végcsoportnál lévő metionint a genetikai információt közvetítő ribonukleinsav (raRNS) AUG transzlációs startjele kódolja, és például az Escherichia coli törzsben történő kifejezéskor a gazdasejtek nem távolitják el. Más mikrobiológiai rendszerek - például a Pseudomonas - eltávolíthatják a metionint, amelyre, úgy tűnik, nincs feltétlenül szükség az aktivitáshoz. Ha a metionin nincs jelen, az alkalmazott rendszertől függően, a GLN-maradék piroglutaméttá ciklizálódhat, ismét anélkül azonban, hogy az aktivitás csökkenne. Azt tapasztaltuk, hogy a Gray és munkatársai által korábban leirt, a CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó rekombináns gamma-interferon stabilitása számára kedvező, ha emberi szérum albumint is teszünk az interferont tartalmazó gyógyászati készítménybe. Ahhoz azonban, hogy szérum albumin jelen lehessen a végső liofilizált termékben, szükség van arra, hogy bizonyos minőségellenőrző lépéseket végezzünk, inkább a liofilizálás előtt, mint a kész termékkel. A találmány szerinti új rekombináns gamma-interferon esetén viszont a liofilizált alakban jelenlevő anyag szérum albumin bevitele nélkül is eléggé stabilnak bizonyult. Kívánt esetben azonban a találmány szerinti gamma-interferonokhoz is adhatunk gyógyászatilag elfogadható mennyiségű emberi szérum albumint. A fentieken túlmenően, a CYS-TYR-CYS- szekvenciát nem tartalmazó, találmány szerinti, emberi eredetű rekombináns gamma-interferonok a citopatikus hatás gátlásával kapcsolatos vizsgálatoknál lényegesen nagyobb vírusellenes hatást mutattak, mint a CYS-TYR-CYS- szekvenciával rendelkező analógjaik. Az aktivitást a szokásos módon mikrotitráló lemezeken vizsgáltuk enkefalomiokarditisz vírus A549 emberi tüdókarcinoma sejteken kifejtett citopatikus hatása gátlása alapján. [Lásd W.E. Stewart II, .The Interferon System', Springer Verlag, New York, 1979, 13-26. oldal]. A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonok mindegyike tartalmazza a fenti teljes szekvencia első 126 aminosavját. A teljes szekvenciához képest a karboxil-végcsoportot tartalmazó végükön különbözőképpen megrövidített gamma-interferonok továbbra is mutatják az emberi eredetű gamma-interferon jellemző tulajdonságait, jóllehet egyes esetekben csökkentett mértékben, mindaddig, amíg tartalmazzák az 1-től 126-ig terjedő aminosavakat. Valóban, a Derynck és munkatársai fentebb idézett munkájában leírt, a CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó analóggal folytatott kísérletek azt mutatták, hogy idegen szekvenciákkal lehet helyettesíteni a jelen számozás szerinti 132. aminosav utáni részt anélkül, hogy az aktivitás megszűnne. [Lásd például Derynck, R. és munkatársai, Interferon Scientific Memoranda, August 1982, Memo-l-A1193/2. ]. A rendelkezésünkre álló kezdeti bizonyítékok alátámasztják azt a feltevést, hogy amíg az 1-tól 126-ig (THR) terjedő aminosavak viszonylag szorosan vannak kötve egy háromdimenziós konfigurációban, amelyet öszszefüggésbe hozunk az aktivitással, a teljes szekvenciában jelenlevő többi aminosav kevésbé van határok közé szorítva, és viszonylag érzékeny a proteolízisre. A korlátozó körülmények között végzett tripszines emésztés eltávolítja a szekvencia különböző részeit a 126. aminosav után, előtte azonban nem. Az általunk előállított, természetben előforduló (natív) gamma-interferonok molekulája különféle módon nyúlik túl a 127., 128., 129., 130., 132. és 134. számú aminosavon. Észleltünk olyan, teljesen aktiv rekombináns gamma-interferont, amelynek az aminosav-szekvenciája a metionin után különféleképpen tartalmazta az 1-tól 139-ig és 1-től 131— -ig terjedő aminosavakat. Ez utóbbit a rekombináns gamma-interferon korlátozott mértékű tripszines emésztésével nyertük, majd azonosítottuk a szekvenciákat. A tripszinnel feltárt hasonló töredékek, amelyek változó módon a 128. és 129. aminosav körül végződtek (a metionin után) megőrizték az aktivitásukat, jóllehet az jelentősen kisebb volt. Másrészt viszont az N-végcsoportú metioninon kívül 125 aminosavat tartalmazó anyag - amelyet úgy kaptunk, hogy emésztéssel eltávolítottuk a 126-os helyzetű treonint és az utána következő aminosavakat - aktivitása a feltáratlan anyag aktivitásának még 1%-át sem tette ki a citopatikus hatás gátlásánál. A re kombinálással előállított gamma-interferon - amellett, hogy tartalmaz a lánc elején egy metionint, feltéve, hogy az nem hasad le a gazdasejtekben a képződés során - nagyobb részarányban egy 139 aminosavat tartalmazó anyagból, kisebb részarányban pedig egy 143 aminosavat tartalmazó anyagból áll (az 1. ábrán feltüntetett számozási rendszer alapján). A két anyag összetétele körülbelül 95%-nál nagyobb mértékben, különösen előnyösen mintegy 97%-nál nagyobb mértékben felel meg a 139 aminosavból álló anyagénak. A korlátozó körülmények között végzett tripszines emésztés hasonló módon eltávolítja a különböző részeket a 126. aminosav után. Az ilyen korlátozó tripszines emésztés után a rekombináns gamma-interferon olyan anyagokból áll, amelyek 125 aminosavat (a lánc elején lévő metioninnal együtt 126 aminosavat), 129, 131 és 134 aminosavat tartalmaznak. Ezek az anyagok megőrizték az aktivitásukat, bár az jelentősen csökkent, mivel károsodott a 125. aminosav és a 129. aminosav közötti rész. Gyakorlatilag teljesen aktívak maradnak azok az anyagok, amelyek legalább 129 aminosavat, különösen pedig legalább mintegy 131 aminosavat tartalmaz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
