202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
13 HU 202277 B 14 Ha eredményként 43 pmól/g-ot kapunk, úgy az egyes kondenzációs lépéseknél átlag 85%-os kihozatalt értünk el. A metil-gyök lehasitása a foszforsav-triészter csoportról: A hordozót tiofenol, trietilamin és dixoán 1:1:2 arányú keverékének 4 ml-ével 45 percig rázzuk, ezután metanollal, majd éterrel mossuk. A bázis.-védöcsoport lehasitása és ezzel egyidejűleg a hexanukleotid lánc lehasitása a polimer hordozóról úgy történik, hogy a hordozót 14 órán át 10 ml tömény ammónium-hidroxid oldattal 50 °C-on melegítjük, ezután a vizes oldatot leszívjuk és a szűrletet 2 ml-re betöményitjük. A termék tisztítása: Az Így kapott nyersterméket, amelynek 5’ végén még egy dimetoxi-tritil-védócsoport van, fordított fázisú (reversed-phase) HPLC-vel vizsgáljuk. Oszlop: p-Bondapak Cis (Waters); oldószer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 25% acetonitrillel; átfolyás sebessége: 2 ml/perc; retenciós idó: 14 perc. Az összegyűjtött frakciókat körülbelül 1 ml-re bepároljuk, hozzáadunk 10 ml 80%-os ecetsavat és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután 50 °C-on vákuumban szárazra pároljuk, az üledéket 25 ml vízben feloldjuk és a lehasadt dimetoxi-tritanolt háromszor 15 ml éterrel extraháljuk. A vizes fázist újra szárazra pároljuk, az üledéket 2,5 ml vízben feloldjuk, Biogel P2 oszlopon (oszlop: 60x1,7) sótlanitjuk és liofilizáljuk. A termék vizsgálata: Tisztasági kontrollként az analitikai HPLC-diagramm szolgált (oszlop: 300x3,9 cm, p-Bondapak Cis (Waters); eluáló oldat: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ral/perc; retenciós idő: 3,7 perc). VII. példa A d-TAAGGAGGTTTA szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 300 mg (30 manói) DMTrdAb* • A termék HPLC-diagramja: Oszlop: 300x3,9 mm, p-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 4,4 perc. A d-AGCTTAAACC szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 200 mg (16 /Limól) DMTrdC1“ J,?) A termék HPLC-diagramja: Oszlop: 300x3,9 ram, p-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 12% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 3,4 perc. VIII. példa IX. példa A d-CATCTTTA szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 150 mg (1,32 pmól) DMTrdA1“ A termék HPLC-diagramja: Oszlop: 300x7,8 mm, p-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH =7) 20% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idó: 7,7 perc. X. példa A d-AGCTTAAAGATG szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 200 mg (16,2 pmól) DMTrdG11** J© x-A termék HPLC-diagramja: k Oszlop: 300x7,8 mm, p-Bondapak (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 26% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 5,2 perc. XI. példa A d-TGTGATCTGCCTCA szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz analóg módon állítjuk elő, a kiindulási anyag 250 mg (22 pmól) DMTrdAbI A termék HPLC-diagramja: Oszlop: 300x7,8 mm* p-Bondapak Cis (Waters); Eluáló szer: 0,1 M trietil-ammónium-acetát puffer (pH=7) 25% acetonitrillel; átfolyás: 1,5 ml/perc; retenciós idő: 6,1 perc. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9
