202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
15 16 HU 202277 B A d-CAGATCACA szintetizálása A nukleotidot a VI. példában leírtakhoz 5 analóg módon állítjuk eló, a kiindulási anyag 150 mg (13,2 jLimól), DMTrdA*« j£). A termék HPLC-diagramja: Oszlop: 300x7,8 mm, u-Bondapak Cu (Waters); Eluáló szer; 0,1 M trietil-ammónium-acetát 10 puffer (pH=7) 20% acetonitrillel; átfolyás: 0,2 ml/perc; retenciós idő: 5,2 perc. Az oligo-dezoxinukleotidok analízise 15 A szintetikus úton előállított oligo-dezoxinukleotidok szekvencia analízisét akkor végeztük el, amikor ezeket mér a pER 33 interferon termelő plazmidba beépítettük (lásd a 20 2. példát: a pER 33 interferon plazmid szekvencia analízise). Ezzel a vizsgálattal egyidejűleg az oligo-dezoxinukleotidokban lévő bázisok sorrendjének helyessége is bizonyítást nyer (lásd az 5. ábrát). 25 XII Példa 1. példa A pER 103 expressziós plazmid szerkesztése 30 A pER 103 expressziós plazmid szerkesztését az 1. ábrán sematikusan mutatjuk be. 35 a) A promoter/operátor fragmentum izolálása A Serratia marcescens mintegy 1000 bp hosszú triptofán operonjának mintegy 1000 bázispárját tartalmazó pBR 101 plazmidot 40 használjuk kiindulási anyagként a promoter/operátor szakasz izolálásához. Ez a regulator szakasz egy 90 bp hosszú Eco Rí - Hae III fragmentumon belül helyezkedik el, amelyben a promoter az Eco RI-töl a Hae III 45 felé irányított. A pBR 101 a triptofán operon-fragmenst a Sáli hasitási helytől [lásd Nature 276, 684 (1978) 1. ábra] a transzkripciós starthely utáni 128 nukleotidig (lásd a 2. ábrát ugyan- 50 ott) tartalmazza. Ezt a fragmenst a pBR322- -be a Sáli és EcoRI hasitási helyek közé toldják be, amikor a pBR322 652 bázispár hosszúságú EcoRI-Sall fragmense kicserélődik, és a pBR101-et kapják. Ennél a konst- 55 rukciónál az EcoRI és Sáli hasitási helyek megmaradnak. A fenti 90 bp hosszúságú, a -74. nukleotiddal kezdődő (EcoRI hasitási hely) és a 16. nukleotiddal végződő (Hae III hasitási hely) fragmens a triptofán operátort 60 tartalmazó plazmid EcoRI-gye) majd HaelII-mal végzett hasításával kapható. A pBR 101 plazmidból körülbelül 25 ug-ot emésztünk Eco Rí restrikciós enzimmel, a keletkezett két fragmentumot gélelektroforé- 65 10 zissel (1,4% agaróz) választjuk el egymástól és a 200 bp hosszú fragmentumot a gélből elektroforézissel eluáljuk. Ezt a fragmentumot ezután Hae III-al emésztjük, a két emésztési terméket 6%-os poliakrilamid gélben választjuk el és a 90 bp hosszú fragmentumot (promoter/operátor) is izoláljuk a gélből. b) A riboszómakötő szekvencia (RBS) szerkesztése Az RBS-t három szintetikus oligonukleotidból állitjuk össze: a 6mer 5'-TCCTTA-ból, a lOmer 5’-AGCTTAAACC-ból és a 12mer 5’-TAAGGAGGTTTA-ból. A 6mer-ből 500 pmól-t polinukleotid-kináz enzim segítségével foszforilálunk és egyben radioaktiv izotóppal jelöljük (lásd az A fejezetet). A reakciókeveréket 10 percig 70 °C-on melegítjük, hogy a kinázt inaktiváljuk, s ezután a nem foszforilált lOmer-ból és 12mer-ből ekvimoláris mennyiségeket adunk hozzá. Az oligonukleotid keveréket ekkor 95 °C-ra hevítjük és ezután lassan (körülbelül 3 óra leforgása alatt) 30-35 °C-ra hűtjük, miközben az oligonukleotidok egymással hibridizálnak: 5’ HO 3' 12mer d TAAGGAGGTTTA dATTCCTCCAAATTCGA t------------»i . j 6mer lOmer 3* 5’ 0,25 mM ATP és 5 mM DTT hozzáadásával és a DNS-ligáz enzim segítségével a 6mer és 12mer között kovalens kötést létesítünk (lásd az A fejezetet). Az a körülmény, hogy a 12mer-ek és 10mer-ek 5’ végei nem voltak foszforiláltak, megakadályozta, hogy multimer ligációs termékek keletkezzenek. A reakció lezajlása után a keveréket 10 percig 70 °C-on melegítjük, hogy a ligézt inaktiváljuk, majd 0,5 mM ATP-t és 5 mM DTT-t adunk hozzá, hogy egy további kináz reakció révén (lásd az A fejezetet) a 12mer-ek és 10mer-ek 5’ végei is foszforilálódjanak, s ezzel az RBS elkészüljön. c) A promoter és az RBS összekapcsolása A 90 bp hosszú Eco RI - Hae III Promoter/operátor fragmentum 12 pmólnyi mennyiségét standard körülmények között (lásd az A fejezetet) 60 pmól RBS-el kapcsolunk öszsze. Minthogy a 90 bp hosszú fragmentumnak csak a Hae III hasítással előállított tompa végét (blunt-end) lehet az RBS tompa végével ligázzal összekapcsolni, csak olyan molekulák keletkeznek, amelyek az RBS-t a megfelelő irányban, a promotertöl lefelé irányitottan tartalmazzák. A reakció lezajlása után a ligázt 10 percig 70 °C-on inaktiváljuk, majd beállítjuk a TA-puffer koncentrációt (lásd az A fejezetet) és 200 egység Hind III-mal és 10
