202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
19 HU 202277 B 20 juk, miáltal megkapjuk a kívánt 34 bp hoszszú Sau 3A-Ava II fragmentumot és egy 143 bp hosszú fragmentumot. Ezzel paralel a 646 bp hosszú interferon-specifikus Ava II fragmentumot, amely a 177 bp hosszú Sau 3A fragmentumon belüli Ava II hasitási helytől a terminéciós kodon mögöttig terjed, az 1 F7 plazmidból kipreparéljuk. Ebből a 646 bp hosszú Ava II fragmentumból 0,5 pg-ot a 34 bp hosszú és 143 bp hosszú Sau 3A - Ava II fragmentumok keverékével együtt DNS ligéz enzimmel inkubálunk (kohéziós végek összekapcsolása, lásd az A fejezetet). Ezáltal olyan Ava II fragmentumok jönnek létre, amelyeket - kovalens kötés által - Ava II-Sau 3A fragmentumok határolnak. Ahogy egy Ava-II-Sau 3A fragmentum egy Ava II fragmentummal kapcsolódik, ezen a helyen további kapcsolódások nem képződhetnek, mivel a Sau 3A végek defoszforilálódtak. A ligéz reakció után a reakció keveréket 70 °C-on 10 percig melegítjük, hogy az enzim inaktiválódjék, ezután 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk hozzá, s igy a defoszforilált Sau 3A végeken újból végbemegy a kinéz reakció (lásd az A fejezetet). A reakciókeveréket 6%-os poliakrilamid gélben választjuk el és a 700-800 bp hosszú molekulákat (egy 646 bp hosszú Ava II fragmentum, amelyet két Ava II-Sau 3A fragmentum határol), valamint az 1300- -1500 bp hosszú molekulákat (két egymáshoz kapcsolt 646 bp hosszú Ava II fragmentum Ava II-Sau 3A fragmentumokkal határolva) eluáljuk. b) Az alábbi formulájú oligonukleotid-komplex előéllitása 12mer | 14mer f—— --------------1 l—it---------------------1 5' AGCTTAAAGATGTGTjGATCTGCCTCA 3’ atttctacacactagJac Hin dili ! 8mer 9mer i MetCy6 ^-Sau 3A Négy szintetikus úton előállított oligonukleotidot, azaz egy 14mer 5’ TGTGATCTGCCTCA-t, egy 12mer 5’ AGCTTAAAGATG-t, egy 9mer 5’ CAGATCACA-t és egy 8mer 5’ CATCTTTA-t a következőképpen reagéltatunk: a 8mer, 9mer és lOmer mindegyikéből 250 pmól-t foszforilálunk (lásd az A fejezetet), a reakció végbemenetele után a kinázt 95 °C-on inaktiváljuk, az oligonukleotid keverékhez 250 pmól nem foszforilélt 12mer-t adunk, majd a keveréket lassan (3 órán át) 35 °C-ra hűtjük, hogy lehetővé tegyük az oligonukleotidok hibridizációját. Ezután a keverékhez 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk és az oligonukleotidokat ligáz reakcióval egymáshoz kapcsoljuk (.blunt-end* ligáz reakció, lásd az A fejezetet). Tekintve, hogy a 12mer 5* vége nem foszforilélt, dimerek nem képződnek; a 14mer-ek túlnyúló végei egymással nem komplementerek, igy ez sem vezethet dimerizációhoz. Az összekapcsolt oligonukleotid-komplex egy alikvot mennyiségét (25 pmól) 80 egység Sau 3A-val emésztjük, hogy az interferon génhez illeszkedő Sau 3A véget előállítsuk. Ennek érdekében a mintát 10 percig 75 °C-on melegítjük, fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Ezzel a lépéssel azt a linker-fragmentumot, amely az interferon gént a Hindlll-mal hasított pER 103-al a találmány szerint összeköti, elkészítettük. c) Az interferon gén és az oligonumkleotid-komplex összekapcsolása, ligéz reakció a pER 103-ban Az izolált interferon fragmentumokat (lásd a 2a. példát), amelyek körülbelül 1 pmól-nyi molekulát képviselnek, összekapcsoljuk a Sau 3A-val hasított oügonukleotidkomplex-el (kb. 25 pmól) a kohéziós Sau 3A végek ligáz enzimes reakciója révén (lásd az A fejezetet). Ez esetben is gátolt a multimerek felépülése, mivel az oligonukleotid-komplex (12mer) Hindui végéről hiányzik a foszfát csoport. Olyan interferon gén molekulák keletkeznek, amelyeket mindkét végükön egy szabad Hindin végű oligonukleotid-komplex határol. A ligáz hódenaturálása után, a reakciókeverékhez 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t adunk, s így ezek a végek Í6 foszforilálódnak (lásd az A fejezetet), majd izopropanollal kicsapást végzünk (lásd az A fejezetet), hogy a ligáz reakcióban ugyancsak keletkezett oligonukleotid-komplex dimereket leválasszuk. A szerkezetet ezután a 0,05 pg HindIII-al hasított, foszfatázzal kezelt pER 103-al összekapcsoljuk (kohéziós végek öszszekapcsolása; lásd az A fejezetet). A HindIII-al hasított plazmid foszfatázzal történő kezelése (lásd az A fejezetet) csökkentette a plazmid újbóli gyűrűbe záródását a ligáz reakció folyamán, igy egy olyan plazmid keveréket állítunk elő, amely 50%-ban interferon termelő plazmidokat tartalmaz (ezek azok a plazmidok, amelyek a gén elején egy 34 bp hosszú Sau 3A-Ava II fragmentumot a 646 bp hosszú Ava II fragmentummal ÖBSzekapcsoltan tartalmazzák - lásd a 2a. példát). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
