202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
21 HU 202277 B 22 d) Escherichia coIi.HB 101 transzformálása és a transzformáció vizsgálata interferon termelés szempontjából A 2c. példa szerint előállított plazmid keveréket az le. példában leírtakhoz analóg módon Escherichia coli HB 101 transzformáláséra használjuk [lásd Dworkin és Dawid, Dev. Bioi. 76, 435-448 (1980]. A kapott transzformáit sejtek mintegy 20%-a (a többi gyűrűbe záródott pER 103 plazmid volt) tartalmazott inszertumot, s ezek közül többet interferon expresszióra vizsgáltunk. 100 ml M9 minimál táptalajban tenyésztjük a baktériumokat, 0,6- -0,8 optikai sűrűség eléréséig. A táptalajhoz előzőleg hozzáadjuk az összes aminosavat (aminosavkén* 20 pg/ml-t), kivéve a triptofánt, valamint tiamint (1 pg/ml-t), glükózt (0,2%-ot) és a triptofán operon induktorát, az indol-3-akrilsavat [IAA, 20 pg/ml; lásd Hallewell és Emtage, Gene, 9, 27-47 (1980)]. A baktérium sejteket 10 percig 7000 ford./perc mellett centrifugálással ülepítjük, egyszer mossuk 50 mM trisz-sósav (pH=8) és 30 mM nátrium-klorid keverékével, majd ugyanezen puffer 1,5 ml-ében szuszpendáljuk. A szuszpenziót 1 mg/ml lizozimmel 30 percig jégben inkubáljuk, majd a baktériumokat ötször fagyasztjuk és felolvasztjuk és ezután a sejt.-törmelékeket egy órai 40.000 ford./perc melletti centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót sterilre szűrjük és interferon aktivitását plakk-redukciós módszerrel [Arch. Virol. 72, 169-178 (1982)] - V3 sejtekkel és vezikuláris-sztomatitisz-vírussal - határozzuk meg. A kiónoknak (inszertummal rendelkezők) mintegy fele tekintélyes interferon expreszsziót mutatott: 1 liter tenyészet 2x10* egységet (nemzetközi referencia egység) tartalmazott. Az interferont ismert módszerekkel nyerjük ki, és tisztítjuk [Nature 285, 446 (1980); J. Bioi. Chem., 256, 9750 (1981)]. e) A pER 33 interferon termelő plazmid szekvencia analízise Egy ilyen interferon termelő kiónt (pER 33) kiválasztottunk és a promoter/operátor szakasztól kezdve az interferon génen belülre terjedő részig szekvencia analízist végeztünk, hogy megállapítsuk a megszerkesztett plazmid helyes voltát. A szekvencia analízis itt is Maxam és Gilbert módszerével [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 (1977)] történt és az Eco Rí hasítási hely radioizotóppal jelzett 3’ végétől kiindulva az interferon gén irányéba haladt. A várt szekvenciát kaptuk, amelynek egy részletét az 5. ábrán mutatjuk be. Ebben a részben a pER 33 szerkesztéséhez felhasznált ÖBszes oligonukleotid fragmentum szerepel. Az előbbiekben említett tulajdonságok alátámasztják, hogy a találmány szerint előállított pER 103 expressziós plazmid a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/operátor szekvenciáját egy szintetikus riboszómakötő szekvenciával kombináltan tartalmazza. A leukocita interferon példájával bemutathattuk, hogy a pER 103 expressziós plazmidba megfelelő módon beépített gének magas értékű expressziót mutatnak. A pER 103 expressziós plazmidot az Escherichia coli K 12 és HB 101 törzsben letétbe helyeztük a budapesti megállapodás alapján a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Griesbach Strasse 8, D-3400 Göttingen) törzsgyűjteményében 1983. október 27-én, DSM-2773 letéti szóm alatt. 3, példa A pER 21/1 interferon termelő plazmid szerkesztése A pER 21/1 plazmid szerkesztésének sémáját a 6. ábrán mutatjuk be. a) Az IFN-cCA gén preparálása a pER 33-ból 2 ug pER 33-at Eco RÍ és Bam Hl restrikciós enzimmel hasítunk, miáltal két fragmentum keletkezik, egy körülbelül 1300 bp hosszú és egy körülbelül 4000 bp hosszú. Ezeket a fragmentumokat 1,2 X-os agaróz gélben elektroforézissel választjuk el. A rövidebb fragmentumot a gélből elektro-elúcióval izoláljuk. E DNS végeit egyenként 1,25 nmól dATP, dGTP, dCTP és dTTP, valamint 2 egység Klenow fragment (DNS polimeráz I) hozzáadásával tompa végekké (blunt-end) alakítjuk. A DNS-t fenolos extrahálással és etanolos oldatból történő kicsapással tisztítjuk, majd 15 pl vízben vesszük fel. Körülbelül 15 pmól Eco RI-linkert (New England Biolabs Inc.) 5 pl oldatban s-32?-ATP és T4 polinukleotid kinéz hozzáadásával 5’ végein foszforilálunk. A kinéz hődenaturálása után a DNS-hez 5 nmól ATP-t és 0,1 egység T4 ligázt adunk és 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk. A reakcióterméket az alacsony molekulatömegü anyagoktól izopropanolos kicsapással tisztítjuk meg. Végül a DNS-t 20 egység Eco Rí restrikciós enzimmel hasítjuk, még egyszer tisztítjuk izopropanolos kicsapással és 10 pl vízben feloldjuk. b) A pER 33 plazmid linearizálása Körülbelül 2 pg pER 33-at Eco Rl-restrikciós enzimmel kezelünk. Ezután alkalikus foszfatázt adunk hozzá, hogy az 5’-foszfót csoportot eltávolitsuk. A körülbelül 5300 bp hosszú, lineáris DNS-t 1,2%-os agaróz gélben elektroforézissel, majd elektro-elúcióval a 5 10 15 20 ,2ó 30 35 40 45 50 55 60 65 13
