202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
15 HU 202276 B 16 jük 26 perces időközönként, és azonnal olyan csövekbe helyezzük, amely D-Phe-Pro-Arg-klór-metil-ketén (PPACK) és EDTA liofilizélt keverékét tartalmazza 1 umól/l, illetve 4,8 mmól/1 koncentrációban. A csöveket jégre helyezzük és a plazmát elkülönítjük. A triklór-ecetsavval (TCA) kicsapható (ép humán szöveti típusú plazminogén aktivótor) és teljes radioaktivitást mérjük mindegyik plazmamintában. Az- immunreaktiv humán szöveti típusú plazminogén aktivátort szintén mérjük, szendvics-ELISA eljárással, amely poliklonális antitesteket alkalmaz és legalább 30 ng/ml tényleges érzékenységgel bir. Az adatok két típusa alakul ki az in vivo kiürülési tanulmányokból nyulakban. Az egyik az immunreaktiv humán szöveti típusú plazminogén aktivátorból alakul ki, amely a nem jelzett anyag kiürülésének méröszáma lesz. Az adatok második típusa a TCA-val kicsapható radioaktivitás, amely az ép humán szöveti típusú plazminogén aktivátor több, mint 95%-át képviseli.. A plazma-koncentráció görbéit az idővel szemben is immunreaktivitásból és a TCA-val kicsapható számokból illesztjük a megfelelő multiexponenciális modellekhez és a kapott farmakokinetikai paramétereket összehasonlítjuk. 6. példa Endo H-val kezelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátor tarmakokinetikája Az Endo H-val kezelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátornak, kontroll humán szöveti típusú plazminogén aktivátornak, és humán szöveti típusú plazminogén aktivátor egy második kontrolljának, amelyet az Endo H-val kezelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátor reakciójával azonos reakciókörülményeknek vetettünk alá, de enzim nélkül, farmakokinetikai profilját mutatjuk be a 4. ábrában. A két kontroll lényegében azonos profiljai azt mutatják, hogy azok a manipulációk, amelyek szükségesek a 117. helynél levő egyszerű cukrok eltávolításához, nem vesznek részt a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor kiürülésében történő változásban. Az Endo H-val kezelt humán Bzöveti típusú plazminogén aktivátor lassabban ürül ki. Az adatok elemzése azt jelzi, hogy növekedés van az alfa fázisú kiürülési sebességben a béta fázishoz tartozó zéró időpontra extrapolált növekedésen kívül. Az Endo H-val kezelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátornak megnövekedett biológiai hozzáférhetősége van, amint ezt az idő és koncentráció szorzatának integráljából mérjük; ez a biológiai hozzáférhetőség viszonylag hipotézis-mentes mérése, amelyet a görbe alatti terület ad meg, és amely mintegy 2 faktorral növekszik az Endo H kezeléssel. Mindegyik vizsgálati csoport nem jelzett humán szöveti típusú aktivátor hordozót kap. A nem jelzett humán szöveti típusú plazminogén aktivátor farmakológiai profiljai egyetlen esetben sem különböznek a vizsgált csoportban. Ez úgy működik, mint belső kontroll, hogy igazolja, hogy bármelyik adott csoporthoz választott nyulak véletlenül nem rendelkeznek-e szokatlan kiürülési jellemzőkkel. Glum- t-PA és GlNii7Glu275 t-PA mutánsok farmakokinetikáia A glutaminm t-PA és a kontroll humán t-PA farmakokinetikóját mutatja be az 5. ábra. A glutamimn t-PA lassabban ürül ki, mint a kontroll. Hasonló profilt mutatunk be a 6. ábrában glutaminii7glutaminsavz75 t-PA-nál, amelyet a 3. példában irtunk le. Fibrin-kötési jellemzők A fibrin-kötés különösen fontos tényező, amely valószínűleg közvetlenül a fibrin fajlagossággal függ össze, amellyel a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor rendelkezik in vivo. Az Endo H humán szöveti típusú plazminogén aktivátor fibrin kötését két eljárással értékeljük. Az első eljárás humán szöveti típusú plazminogén aktivátor befogását használja fel egy standard mikrotitróló lemezben levő üreget beborító fibrinbe; ezután mindegyik üreget kimossuk ób plazminogén oldatát, valamint plazminhoz való homogén 8Zubsztrátumot (S-2251, Kabi) adunk hozzá. A szin, amely kifejlődik, arányos a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor mennyiségével, amely a kiindulási lépésben befogódott [Angles-Cano: Thrombosis and Haemostasis 54, 171 (1985)]. A fibrin kötés mérésének második típusa humán szöveti típusú plazminogén aktivátornak azt a mennyiségét méri (ELISA-val), amelyik oldatban marad, amikor trombint adunk plazminogénmentes fibrinogén és humán szöveti típusú plazminogén aktivátor [Rijken és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 2920 (1982)] oldatához. Jelenleg még nem világos, melyik vizsgálati méréB adja meg megfelelően a megváltozott humán szöveti típusú plazminogén aktivátor fibrinkötés in vivo következményeit. A kétféle mérésből származó adatokra alapozva arra a következtetésre jutunk, hogy az Endo H-val kezelt humán szöveti tipuBÚ plazminogén aktivátornak legalábbis változatlan, de inkább javult fibrin fajlagossága van. Hasonlóképpen a 3. példa szerinti glutaminu7glutaminsavz7s t-PA fibrin-kötés vizsgálati adatai azt demonstrálják, hogy a glutaminu7glutaminsavz7S t-PA hasonló a glutaminsavm t-PA-hoz, és jobb a t-PA kontrolinál a fibrin stimulálásában és a fajlagos aktivitásban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
