202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására

13

HU 202276 B

14

I. táblázat

Minta

Fuc

Man

Gal

GlcNAc

Siab

Komplex tipusc

1.0

3.0

2.8

4.2

2.4

Nagy mannóz tartalmú tipusd

0.6

6.2

nyom

2.0

0

•Rövidítések: Fuc =

fukóz, Man

= mannóz

, Gál = gálák tóz,

GlcNAc = N-acetil-glükózamin, Sia =

sziálsav

bTiobarbitursavas mérés formalizálva 3 mannózra formalizálva 2 GlcNAc-ra

5. példa

Endo-fl-N-acetil-glükózamidináz H-t (Endo H) szerzünk be a Genzyme Incorporated-t61. SDS-PAGE-t hajtunk végre, amint ezt Laemmli leírta [Nature, 227, 680 (1970)].

0,8 mg humán szöveti típusú plazminogén aktivátort (amelynek előállítását a 93 619 számon közzétett, fentebb idézett Európa szabadalmi bejelentés Írja le) (0,2 ml formulázó pufferben, amely 0,01% Tween 80-at is magában foglaló 0,2 mól/1 arginin-foszfátot, pH 6, tartalmaz) összekeverünk Endo H-val (0,1 egység 0,05 ml 25 mmól/l-es nátrium-foszfátban, pH 6) és nátrium-aziddal (0,02%). A mintát 37 °C hőmérsékleten 20 órán át inkubáljuk. Kontroll humán szöveti típusú plazminogén aktivátor mintát készítünk és azonos módon inkubáljuk azzal a kivétellel, hogy az Endo H oldatot nátrium-foszfát oldattal (0,05 ml, 25 mmól/1) helyettesítjük. Inkubálás után a mintákat 0,75 ml teljes térfogatra hígítjuk formulázó pufferral, és erőteljesen dializáljuk az azonos formulázó pufferral szemben. A mintákat szűrjük (0,4 mikronos HV szűrő, Amicon), és 40 °C hőmérsékleten tároljuk.

A deglikozileződést SDS-PAGE-val követjük redukció és karboximetilezés után. Az Így készített humán szöveti típusú plazminogén aktivátor alikvotjait (0,05 mg 0,01 ml formulázó pufferben) összekeverjük 25 mmól/ /1-es nátrium-foszfáttal (0,015 ml) és 2 x Laemmli minta-pufferral, amely 20 mmól/1 ditiotreitolt tartalmaz (0,025 ml). A mintákat 5 percig 95 °C hőmérsékleten melegítjük és hagyjuk lehűlni. Jódecetsavat (0,015 ml, 0,67 mól/l-es koncentrációjú, 1 n NH«0H-val készített oldatban) adunk hozzá és a mintát sötétben inkubáljuk 3 órán át szobahőmérsékleten. A redukált, karboximetilezett mintákat SDS-PAGE-val elemezzük.

Ebben az elemzésben kezeletlen kontroll

2.-láncú humán szöveti típusú plazminogén aktivátort felbontunk három fő csikra, amely megfelel a Kringle I típusnak (glikozilezés a 117. és 184. helyzeteknél), a Kringle 11 típusnak (glikozilezés a 117. helyzetnél) és proteáznak (1. ábra, 1. vonal). A humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor emésztése Endo H-val növeli mindkét Kringle-tipus esik elektroforetikus mobilitását, de nem hat a 20 proteáz esik mobilitására (1. ábra, 2 esik).

Az Endo-H-val kezelt humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor fibrinolitikus aktivitását in vitro vérrög-lizálásos vizsgálattal határozzuk meg Collen és munkatársai mód- 25 szere szerint [J. Clin. Path. 21, 705 (1968)]. Az Endo-H-val kezelt humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor ebben a mérésben megkülönböztethetetlen a nem kezelt kontroliétól.

30 A humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor mintákat az Iodobead eljárással jódozzuk [Markwell: Anal. Biochem 125, 427 (1982)] mintegy 2 u Ci/pg fajlagos aktivitásra. 0,2 mól/1 arginin, 0,1 mól/1 citrát (pH 6,0) 35 és 0,01% Tween 80 az alkalmazott puffer öszszetétele minden esetben. Az összes mintát ebben a puff er ban dializáljuk a jódozás előtt. A pH-t trisz-bázissal 8,2-re állítjuk be jódozás előtt. A jódozási keveréket PD-10 40 oszlopon (Pharmacia) engedjük keresztül, amely 6,0 pH-jú pufferral van kiegyensúlyozva, az üres térfogatból származó radioaktív frakciókat összegyűjtjük, SDS-PAGE-vel futtatjuk, é6 a kiszárított gélt autoradi- 45 ográfiának vetjük alá. A jelzett humán szöveti tipusú plazminogén aktivátorok autórádió gráf iá ja azt mutatja, hogy a radioaktivitás több, mint 95%-a beépült a humán szöveti ti- Pubú plazminogén aktivátorba.

50 Mindegyik jelzett szöveti tipusú plazminogén aktivátort összekeverjük nem jelzett anyaggal 1:200 arányban (jelzett: nem jelzett, tömeg/tömeg), és i.v. injektáljuk gyógyszerként olyan nyulakba, amelyeknek a fülében 55 artériás katéter van. Minden nyúl 1 mg/kg jelzetlen és 10 p Ci/kg jelzett humán szöveti tipusú plazminogén aktivátort kap. A nem jelzett humán szöveti tipusú plazminogén aktivátort hordozóként alkalmazzuk a jelzett 60 humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor nyomnyi mennyiségéhez abból a célból, hogy elérjük a terápiás Bzintet, és elkerüljük a változást a farmakokinetikában, amely a kiürülési útban a koncentráció-függésből lét— 65 rejöhet. Artériás vérminták sorozatát gyűjt9